周俊懌， 方樂堃， 鄧艷紅， 劉煥亮， 王 磊， 汪建平， 黃美近

(中山大學附屬第六醫(yī)院，廣東廣州510655)

晝夜節(jié)律(circadian rhythm)是以24 h左右為周期變動的生命活動，又稱近日節(jié)律［1］。越來越多的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律的紊亂與乳腺癌、結(jié)腸癌的發(fā)病相關(guān)［2－5］。動物都存在著維持晝夜節(jié)律的系統(tǒng)——晝夜節(jié)律蛋白，目前至少發(fā)現(xiàn)9種晝夜節(jié)律蛋白(Clock、Per1、Per2、Bmal1、Cry1、Cry2、Tim、酪蛋白激酶1和糖原合酶激酶3β)［6－8］。目前對晝夜節(jié)律及其調(diào)控蛋白研究日益深入，晝夜節(jié)律對結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、預后存在影響，但目前尚未有報道使用晝夜節(jié)律蛋白對結(jié)直腸癌的預后進行評估。本文旨在探索用晝夜節(jié)律蛋白Cry2對結(jié)直腸癌的預后及新輔助化療敏感性、新輔助化療后的生存期進行預測。

材料和方法

1 材料與對象

選16名規(guī)律地接受包含5－氟尿嘧啶的新輔助化療的結(jié)直腸癌切除術(shù)患者。使用結(jié)腸鏡獲取新輔助化療之前的腫瘤標本。通過CT/MRI計算腫瘤體積的減少率或腫瘤反應速度，從而反映化療療效。使用實體腫瘤療效評估標準來評估化療療效:完全反應(complete response，CR;病灶消失)、部分反應(partial response，PR;縮小≥30%)、病灶穩(wěn)定(stable disease，SD;縮?。?0%或增大≤20%)和病灶進展(progress disease，PD;增大≥20%)。同時，我們收集307名在2001年至2005年間接受結(jié)直腸癌切除術(shù)的患者的腫瘤標本與隨訪資料，這些患者未接受新輔助治療。本研究通過醫(yī)院倫理委員會的批準。以總生存為結(jié)束點，生存時間從手術(shù)當天算起，直至死亡或者最后一次隨訪的時間。

2 主要試劑

免疫組化試劑盒和3，3'－二氨基聯(lián)苯胺(3，3'－diaminobenzidine，DAB;北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔單克隆抗體Cry2(Abcam)。

3 方法

3.1 組織芯片(tissue microarray，TMA)制作［9］組織石蠟塊對照其相應的HE染色玻片，確定腫瘤組織位置，為確保組織芯片樣本代表性及防止掉片導致信息丟失，使用組織芯片儀(MiniCore，ALPHELYS)以直徑2 mm在石蠟塊上取出選定組織(每份標本取2份組織)。每個標本取2個點，制成組織芯片蠟塊，每個芯片蠟塊含12×8個點。標本置于免疫組化專用防脫片載玻片上，制作成組織芯片玻片。

3.2 免疫組織化學 TMA玻片在二甲苯脫蠟，通過梯度的乙醇重新水化，清水洗凈后，置于枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6)中，使用微波加熱3 min修復抗原。冷卻后，于3%過氧化氫中浸泡10 min，消耗內(nèi)在的過氧化物酶，再在室溫下予10%正常山羊血清孵育20 min，封閉非特異性抗原。最后將組織芯片覆蓋上兔單克隆抗體Cry2(Abcam，1∶100稀釋)，置于濕盒中4℃過夜。接著將芯片置于Ⅰ抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)中室溫孵育1 h，最后滴加DAB。最后，用蘇木素復染，鹽酸酒精脫色，并封片。使用普通兔IgG代替Ⅱ抗作為陰性對照。使用免疫組化檢測陽性的組織作為陽性對照。

3.3 免疫組化檢測的評分標準 所有標本均于100和200倍放大下獲取圖片，并由2名獨立的病理醫(yī)生單獨閱片，使用Image－Pro Plus 6.0進行細胞計數(shù)，并進行半定量評分(immunoreactivity score，IRS)。陽性腫瘤細胞比例，1分:＜25%;2分:25%～50%;3分:50%～75%;4分:＞75%。表達強度，0分:無表達;1分:弱陽性;2分:中等陽性;3分:強陽性。然后將2個分數(shù)相乘，通過繪制ROC曲線獲得分界值，IRS 0～4分定義為Cry2低表達，IRS 5～12分定義為Cry2高表達。

4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。ROC曲線分析確定Cry2高、低表達的分界點。Cry2表達和結(jié)直腸癌患者的臨床病理特點間的關(guān)系用χ2檢驗進行分析，用log－rank檢驗進行單因素生存分析，用Cox回歸模型確定獨立預后因素，用Kapla－Meier法繪制生存曲線。設定雙側(cè)P＜0.05為有意義結(jié)果。實驗重復3次。計量資料以均數(shù)±標準差(s)表示。

結(jié)果

1 Cry2在化療敏感和化療抵抗病例中的差異

16名接受以5－氟尿嘧啶為基礎的新輔助化療的結(jié)直腸癌患者，以化療反應分成2組，CR/PR組8名患者，SD/PD組8名，結(jié)果表明，CR/PR組Cry2表達較低，SD/PD組Cry2表達較高，見圖1。因為總例數(shù)為16例，少于40例，用Fisher確切概率檢驗進行分析，差異有統(tǒng)計學意義，見表1、圖2。

Figure 1.Expession of Cry2 in colorectal cancer tissues from chemotherapy－sensitive(A)and chemotherapy－resistant(B)patients(immunohistochemical staining，×200).圖1 化療敏感和化療抵抗患者結(jié)直腸癌組織Cry2的表達

表1 新輔助化療患者Cry2的表達Table 1 .Expression of Cry2 in patients with neoadjuvant chemotherapy(n=8)

Figure 2.Comparison of Cry2 expression between CR/PR and SD/PD groups.CR/PR:complete response/partial response;SD/PD:stable disease/progress disease. s.n=3.＊＊P＜0.01 vs CR/PR group.圖2 CR/PR組和SD/PD組Cry2表達的比較

2 307例結(jié)直腸癌患者基本資料

收集307名2001年至2005年間接受結(jié)直腸癌切除術(shù)的患者，并按Cry2表達的強弱分成2組，見表2。這2組在性別、年齡、腫瘤位置、組織分級、腫瘤分期及采納化療各方面無顯著差異，具可比性。

3 Cry2表達高低對總生存時間的影響

性別、年齡、組織分級、病理學T分期和是否化療對患者的總生存時間均無影響，腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及Cry2表達情況對總生存時間存在影響。結(jié)腸腫瘤、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移、Cry2低表達預后較好，見表3、圖3。

4 Cry2表達是影響預后的獨立因素

性別、病理學T分期、化療與否對生存的影響并非獨立的，年齡、腫瘤位置、組織分級、病理學N分期、病理學M分期和Cry2的表達是影響預后的獨立因素，見表4。

5 Cry2表達是影響化療預后的獨立因素

年齡、腫瘤位置、組織分級、病理學T分期對化療影響并非獨立的。性別、病理學N分期、病理學M分期和Cry2的表達是影響化療預后的獨立因素，見表5、圖4。

討論

1 Cry2對新輔助治療的指導作用

Cry2的表達與晝夜節(jié)律調(diào)整有關(guān)［10］，而晝夜節(jié)律與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［2－5］，結(jié)果顯示SD/PD組Cry2表達較高，而CR/PR組Cry2表達較低。這充分說明了Cry2高表達時化療療效較差，而Cry2低表達時化療療效較好。進一步可以說明，Cry2高表達時，患者化療效果差，可不考慮行新輔助化療，Cry2低表達時，化療效果好，可考慮行新輔助化療。當然我們的研究中，病例數(shù)仍然不足，需繼續(xù)擴大病例數(shù)，使結(jié)果更為可信。

表2 2001～2005年結(jié)直腸癌手術(shù)患者Cry2的表達情況Table 2 .Expression in Cry2 in patients with colorectal cancer excision between 2001 and 2005

Figure 3.The different overall survival time of all the patients with high and low Cry2 expression.圖3 所有病人Cry2表達高低對總生存時間的影響

表3 患者不同預后參數(shù)的單因素分析Table 3 .Univariate analysis of the average survival time of all the patients

表4 所有患者不同預后參數(shù)的多因素分析Table 4 .Multivariate analysis of the overall survival time of all the patients(n=307)

表5 患者接受新輔助化療后不同預后參數(shù)的多因素分析Table 5 .Multivariate analysis of the overall survival time of the patients with neoadjuvant chemotherapy(n=79)

Figure 4.The different overall survival time of the patients who received neoadjuvant chemotherapy between high and low Cry2 expression.圖4 新輔助化療病人Cry2表達高低對總生存時間的影響

2 Cry2預測CRC患者總生存的作用

AJCC第6版中，ⅡA和ⅡB期5年生存率分別為71.6%和 66.4%，IIIA、IIIB和 IIIC期分別為46.2%、40.1%和28.3%。2002年，美國國家癌癥數(shù)據(jù)中心研究發(fā)現(xiàn)，細化III期結(jié)腸癌分期標準可以進一步區(qū)分預后。其中IIIA期(T1～2，N1)5年生存率為59.8%、IIIB期(T3～4，N1)5年生存率為42.0%，IIIC期(任何T，N2)5年生存率為27.3%(P＜0.01)。本研究中，Cry2高表達的病人總生存時間比Cry2低表達的患者總生存時間短。Cry2表達的高低與性別、年齡、腫瘤位置、組織學等級、病理學分級等無關(guān)，同時多因素COX回歸分析的結(jié)果顯示，Cry2高表達可以作為提示結(jié)直腸癌患者預后差的獨立因素。這將為評估患者預后帶來巨大的方便，僅僅通過免疫組化的方法，就可以對結(jié)直腸癌患者預后進行評估，但是目前我們的樣本量仍然有限，在下一步研究中，應繼續(xù)擴大樣本量，并進行多中心研究，明確Cry2作為預后因子的作用。在單因素分析中，其它提示總生存率低的因素分別是腫瘤位置(P＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)和遠處轉(zhuǎn)移(P＜0.01)。

3 Cry2預測新輔助化療效果的作用

文獻報道晝夜節(jié)律對化療療效有相當顯著的影響［11－20］。在我們的實驗中，我們分析了結(jié)直腸癌患者的Cry2表達和新輔助化療治療結(jié)果之間關(guān)系(表5、圖5)。新輔助化療以5－氟尿嘧啶為基礎，加或不加亞葉酸鈣或草酸鉑。Kaplan－Meier分析顯示，Cry2高表達的患者化療后總生存時間仍比對照組短(P＜0.05)，與所有病人(化療和不化療的病人)的總生存情況類似，這說明化療并不能使Cry2表達高的患者生存期延長至與Cry2表達低的患者相同，提示Cry2可以作為化療的預測分子標志物。多因素Cox回歸分析顯示，Cry2高表達預示著更差的預后，所以Cry2可以作為一個獨立的因子，預測結(jié)直腸癌患者新輔助化療后的預后情況。

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