張德宇，張士泰，歐陽(yáng)玲

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

外陰鱗癌（vulva squamous cell carcinoma，VSCC）是外陰最常見(jiàn)惡性腫瘤，多見(jiàn)于老年人，具有生長(zhǎng)快、易復(fù)發(fā)、易誤診或被患者忽視、腹股溝部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早等臨床特點(diǎn)，主要死因是轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)。如果發(fā)現(xiàn)一些反應(yīng)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移傾向的標(biāo)記物，用于高危人群的篩選、首次治療后療效評(píng)估、選擇針對(duì)性治療措施、設(shè)計(jì)相應(yīng)靶點(diǎn)治療藥物，有效降低臨床復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率，將對(duì)VSCC的診斷和治療有著深刻的意義。因此，進(jìn)一步篩選和檢測(cè)腫瘤相關(guān)標(biāo)記物是目前外陰癌研究的重要課題之一。Rho家族蛋白是ras家族中最早被克隆出來(lái)的蛋白，它們是一組相對(duì)分子量為20～25 kDa的三磷酸鳥(niǎo)苷，具有GTP酶活性，被稱(chēng)為Rho GTP酶，研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中存在Rho GTP酶［1］。RhoA是Rho家族蛋白主要成員之一，具有GTP酶活性，RhoA在細(xì)胞內(nèi)以活化GTP結(jié)合形式和非活化GTP結(jié)合形式間循環(huán)，發(fā)揮類(lèi)似分子開(kāi)關(guān)作用，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的橋梁［2］。近年研究表明RhoA在胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與這些腫瘤的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3～6］。但RhoA在VSCC中有無(wú)表達(dá)，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。

本研究采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)RhoA在VSCC組織中表達(dá)情況及其與臨床病理因素的相關(guān)性，以期為VSCC早期診斷、臨床治療及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

隨機(jī)收集盛京醫(yī)院及遼寧省腫瘤醫(yī)院2006年3月至2011年12月間經(jīng)病理證實(shí)、臨床資料完整、有隨訪(fǎng)記錄的40例住院治療的VSCC組織石蠟標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組。另選取10例外陰鱗狀上皮內(nèi)腫瘤2級(jí)（vulva intraepithelial neoplasiaⅡ，VINⅡ）10例、外陰手術(shù)切緣周?chē)Ｆつw10例組織標(biāo)本作為對(duì)照組。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)HE制片。實(shí)驗(yàn)組：40例患者年齡36～81歲，中位年齡為56歲，對(duì)照組年齡44～76歲，中位年齡54歲，兩組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)分級(jí)：鱗狀細(xì)胞癌28例，低分化鱗狀細(xì)胞癌12例，臨床分期：Ⅰ期：5例，Ⅱ期：23例，Ⅲ期：8例，Ⅳa期：4例。淋巴結(jié)：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌11例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌29例。治療方式：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所有患者均采取住院手術(shù)治療，術(shù)前均未接受放療、化療和生物治療。組織學(xué)分級(jí)依據(jù)2004年WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。臨床分期依據(jù)FIGO 分期標(biāo)準(zhǔn)［7］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑：RhoA單克隆抗體，鼠抗人濃縮液（1 mg/mL）純化抗體購(gòu)自香港abcam公司。DAB顯色試劑盒，PBS緩沖液粉劑，檸檬酸組織抗原修復(fù)液粉劑，多聚賴(lài)氨酸均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2.2 方法

1.2.2.1 載玻片、蓋玻片及組織切片的處理：載玻片放入30%鹽酸乙醇清潔液中浸泡24 h，流水沖洗，蒸餾水清洗3遍后浸泡于95%乙醇中6～8 h，晾干；稀釋的多聚賴(lài)氨酸溶液涂片，60℃烤箱烘干后裝盒備用。蓋玻片以30%鹽酸乙醇浸泡24 h，蒸餾水沖洗3次，無(wú)水乙醇沖洗1次，晾干備用。所有石蠟標(biāo)本組織均4 μm層厚連續(xù)切片2張，撈片置于經(jīng)賴(lài)氨酸處理過(guò)的載玻片上，65℃烘烤30 min，使組織緊貼于載玻片上，防止脫片。

1.2.2.2 免疫組化染色：免疫組化Supervision二步法［9］。

1.2.2.3 操作步驟：（1）組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；PBS洗3次；（2）置檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)：（3）取一定量pH6.0檸檬酸鹽緩沖液1 000 mL于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入己沸騰的緩沖液中，緩沖液沒(méi)過(guò)切片，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，從噴氣開(kāi)始計(jì)時(shí)，5 min后壓力鍋離開(kāi)熱源；室溫冷卻，取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次，放入3%甲醇過(guò)氧化氫浸泡 10 min，之后用 PBS 洗 2 次，每次 3 min；（4）切片組織用免疫組化油筆劃圈，防止抗體流散，分別滴加一抗；（5）PBS 洗后滴加二抗，室溫放置 20 min；（6）PBS洗后DAB顯色3～5 min；（7）流水沖洗，蘇木素復(fù)染；（8）1%鹽酸乙醇分化，水洗，PBS 返藍(lán)；（9）95%乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片；（10）光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。（11）免疫組化染色陰性對(duì)照：用PBS代替一抗。

1.2.2.4 結(jié)果判定：免疫組化半定量［8］：RhoA陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)果判斷由2位經(jīng)驗(yàn)豐富但不知受檢病例任何臨床和病理資料的病理科專(zhuān)業(yè)醫(yī)師，對(duì)免疫組化切片進(jìn)行雙盲評(píng)估。每張切片選5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，觀察腫瘤細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色的情況。評(píng)分方法如下：（1）根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)弱（記為a）：無(wú)著色為0分，淺黃或淺褐色為1分，棕黃或褐色為2分，深褐色為3分。（2）根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比（記為b）：1%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%～100%為4分。（3）a與b乘積為IHS評(píng)分：0為（-），1～4分為（＋），5～8 分為（＋＋），9～12 分為（＋＋＋）。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)：記（-）為陰性，（＋）至（＋＋＋）為陽(yáng)性。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用χ2檢驗(yàn)等分析法分析RhoA蛋白表達(dá)與VSCC患者臨床病理因素之間的關(guān)系；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VSCC組織中RhoA蛋白的表達(dá)情況

RhoA陽(yáng)性表達(dá)定位在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈細(xì)小顆粒狀，RhoA在正常外陰皮膚中無(wú)表達(dá)，對(duì)照組VINⅡ陽(yáng)性表達(dá)率10%（圖1，2）。實(shí)驗(yàn)組40例中有31例陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率77.5%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），圖 3，表 1。

2.2 RhoA蛋白與外陰鱗癌臨床病理因素的關(guān)系

高分化和低分化VSCC組中RhoA蛋白的陽(yáng)性100%和68.96%，2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。RhoA陽(yáng)性表達(dá)隨著臨床分期增加而有增強(qiáng)趨勢(shì)（圖4），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)的有所增強(qiáng)（圖5）。表達(dá)率分別為72%和86%，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期VSCC組織中RhoA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為 20%、78.2%、100%和100%，其中Ⅰ期分別與Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅱ期分別與Ⅲ期和Ⅳ期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅲ期和Ⅳ期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RhoA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為

表1 RhoA蛋白在VSCC組織中表達(dá)情況Tab.1 Expression rate of Rhoa protein in VSCC tissue

3 討論

VSCC占外陰惡性腫瘤的80%～90%，多見(jiàn)于60歲以上婦女。VSCC直接浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移較為常見(jiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者手術(shù)治愈率僅為30%～40%，預(yù)后較差。為防止腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，尋求反應(yīng)VSCC侵襲和轉(zhuǎn)移標(biāo)記物，是目前該研究領(lǐng)域重要課題之一［8］。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜多步驟過(guò)程，已有研究表明細(xì)胞因子間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用，RhoA是一種小分子GTP結(jié)合蛋白，無(wú)活性狀態(tài)時(shí)與GDP結(jié)合位于細(xì)胞質(zhì)中，受到細(xì)胞外刺激時(shí)，GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP，RhoA獲得活性、轉(zhuǎn)位于細(xì)胞膜上而發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，活化的RhoA作用于下游效應(yīng)蛋白 Rho 相關(guān)激酶［2，3］。

表2 RhoA表達(dá)與外陰鱗癌各臨床病理因素之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression of RhoA protein and clinical pathologic factors

Rho家族蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展多種因素有關(guān)，包括腫瘤生長(zhǎng)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，細(xì)胞凋亡，腫瘤新生血管生成等［9］。RhoA蛋白是Rho家族成員之一，近年研究發(fā)現(xiàn)RhoA在鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、胃癌，結(jié)直腸癌、肝癌等多種腫瘤組織中表達(dá)并與疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)［10］。理論已闡明RhoA在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制：（1）通過(guò)Rho/ROCK活化信號(hào)傳導(dǎo)通路增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白的收縮力，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力。（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間黏附性，促進(jìn)基質(zhì)降解。

本研究結(jié)果顯示RhoA蛋白在VSCC組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯高于VIN II和正常外陰皮膚組織，2組比較有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與林英姿等［11］卵巢癌的研究結(jié)果有相似性，提示RhoA蛋白參與了VSCC的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示隨臨床分期的增高RhoA蛋白表達(dá)增強(qiáng)（Ⅲ期和Ⅳ期RhoA蛋白的表達(dá)明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的Rhoa蛋白表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），此結(jié)果與顧穎等［12］在子宮頸鱗癌中的研究結(jié)果相似，提示Rhoa蛋白在VSCC發(fā)展，浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中過(guò)度表達(dá)。

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