王銀玲，王億龍，王齊暉，李花，周立平，李富順

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.腫瘤放射治療科，沈陽 110001）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，其死亡率占惡性腫瘤死亡率的第一位［1］，盡管行胃癌根治術(shù)后，5年生存率僅為35%，而且術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)較為常見，其中腹膜轉(zhuǎn)移最常見，約占總復(fù)發(fā)的30%～50%［2］。腹腔沖洗細(xì)胞學(xué)（peritoneal lavage cytology，PLC）檢查方法是目前最常用的腹腔脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法，但該細(xì)胞學(xué)檢查靈敏性較低，很難早期發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)脫落的癌細(xì)胞［3，4］。

近年來隨著寡核苷酸芯片技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用甲基化特異的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（methylation-specific polymerase-chain reaction，MSP）方法檢測(cè)微量腫瘤相關(guān)基因，使腫瘤微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)成為可能。BNIP3是BCL-2蛋白家族促凋亡成員，屬于典型的抑癌基因，該基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。本研究應(yīng)用MSP方法檢測(cè)胃癌組織及腹腔沖洗液中游離細(xì)胞BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，探討其在胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

以我院2008年1月至2010年1月在腫瘤外科手術(shù)治療的80例胃癌患者為研究對(duì)象，其中男48例，女32例，年齡31～79歲，平均51.4歲。術(shù)前胃鏡檢查及病理確診為胃癌，術(shù)前均未行放化療。臨床病理指標(biāo)及PS因素均按日本胃癌病理規(guī)約標(biāo)準(zhǔn)［5］，即 P（+）：肉眼腹膜轉(zhuǎn)移；S（+）：顯微鏡下漿膜受侵。本研究所有患者均自愿加入并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：術(shù)中仔細(xì)止血，若已有腹水，直接吸出100 mL，若無腹水，于Douglas窩、左膈下置入16號(hào)導(dǎo)尿管注入生理鹽水100 mL，輕輕攪動(dòng)后吸出，于0℃下1 200 r/min離心10 min棄上清液，離心后取沉淀，均分成兩份，一部分行伊紅染色（HE），另一部分沉渣標(biāo)本于-80℃下保存以備DNA提取。

1.2.2 提取基因組DNA：苯酚氯仿方法提取組織及腹腔沖洗液基因組DNA，乙醇沉淀。DNA濃度根據(jù)紫外分光光度計(jì)（260 nm）吸光度確定，并根據(jù)260∶280 nm吸光度比值確認(rèn)DNA純度。提取DNA-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MSP：取 1 μg基因組 DNA，65℃重亞硫酸鹽處理 12 h（CpGennome DNA Modification Kit，Intergen，美國），處理基因組DNA（具體方法按說明書），保存于-80℃?zhèn)溆?；使用基因BNIP3甲基化引物和非甲基化引物行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：甲基化引物，5′-TAGGATTCGTTTCGCGTACG-3′（sense），5′-ACCGCGTCGCCCATTAACCGCG-3′（antisense）；非甲 基 化 引 物 ，5′-TAGGATTTGTTTTGTGTATG-3′（sense），5′-ACCACATCACCCATTAACCACA-3′（antisense）。反應(yīng)體系包括重亞硫酸鹽處理后模板DNA 2 μL，BNIP3相應(yīng)的甲基化和非甲基化特異性引物各 0.5 μL，去離子水 16.875 μL、10×PCR 緩沖液（含15 mmol/L MgCl2）2.5 μL、dNTP 混合物 2.5 μL、Taq DNA 聚合酶（Ampli Taq Enzyme，Roche，美國）0.125 μL等，總反應(yīng)體系25 μL。擴(kuò)增條件為95℃變性10 min；94℃變性 1 min，59℃退火 1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物10 μL，3%瓊脂糖凝膠電泳，用GDS8000（UVP，美國）凝膠成像儀拍照分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有資料采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher精確概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化

80例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織，胃癌組、癌旁組BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率分別為83.75%（67/80）、13.75%（11/80），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，見表 1。

表1 胃癌組織與癌旁組織BNIP3甲基化陽性率Tab.1 Methylated ratio ofBNIP3in cancer tissues and noncancerous tissues

2.2 腹腔沖洗液中BNIP3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與胃癌病理特征的關(guān)系

如表2所示，BNIP3甲基化陽性率在PTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤浸潤深度間比較，統(tǒng)計(jì)分析顯示差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）：隨著臨床分期的增加，BNIP3甲基化陽性率明顯升高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的甲基化率為88.9%，較未轉(zhuǎn)移的患者陽性率明顯升高；PS因素與BNIP3甲基化陽性率的關(guān)系顯示，在漿膜受侵S（+）及肉眼可見腹膜轉(zhuǎn)移P（+）的14例中，BNIP3甲基化陽性率為100%，同時(shí)隨著腫瘤浸潤深度的增加，BNIP3甲基化陽性率也明顯增加。

2.3 MSP法檢測(cè)腹腔沖洗液腫瘤相關(guān)基因BNIP3甲基化陽性率與PLC法檢測(cè)腹腔沖洗液脫落癌細(xì)胞的陽性率

80例胃癌患者腹腔沖洗液中，同時(shí)用MSP法檢測(cè)BNIP3甲基化和PLC法檢測(cè)脫落癌細(xì)胞：PLC陽性23例，MSP檢測(cè)BNIP3甲基化陽性58（58/80）例，且PLC檢測(cè)陽性者M(jìn)SP法檢測(cè)均為陽性，MSP法檢測(cè)陰性者中無PLC陽性，MSP法檢測(cè)腹腔沖洗液腫瘤相關(guān)基因BNIP3甲基化陽性率顯著高于PLC法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表2 腹腔沖洗液BNIP3甲基化狀態(tài)與胃癌病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between the methylation status ofBNIP3and pathological characteristics in peritoneal wash samples

表3 MSP法與PLC法檢測(cè)腹腔沖洗液的結(jié)果Tab.3 Results of MSP and PLC tested in peritoneal wash samples

3 討論

胃癌術(shù)后的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因，尤以腹膜微轉(zhuǎn)移最常見，多由腔內(nèi)游離癌細(xì)胞和殘余微小轉(zhuǎn)移灶的存在導(dǎo)致［6］。有研究［7］認(rèn)為，腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞是腹膜轉(zhuǎn)移的先決條件，是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。因此早期發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)游離的癌細(xì)胞并給予有效的阻斷治療，是改善胃癌患者預(yù)后、提高療效的關(guān)鍵。

目前臨床上常用的檢測(cè)方法是PLC，但其敏感性較低，近年來隨著寡核苷酸芯片技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用MSP法檢測(cè)微量腫瘤相關(guān)基因甲基化，大大提高了檢測(cè)的靈敏度。本研究資料顯示80例胃癌患者腹腔沖洗液中，PLC檢測(cè)陽性者M(jìn)SP法檢測(cè)均為陽性，MSP法檢測(cè)陰性者中無PLC陽性，MSP法檢測(cè)腹腔沖洗液腫瘤相關(guān)基因BNIP3甲基化陽性率（72.5%）顯著高于PLC法檢測(cè)脫落癌細(xì)胞陽性率（28.75%）。由此可見應(yīng)用MSP法檢測(cè)腹腔沖洗液BNIP3甲基化可作為胃癌早期微轉(zhuǎn)移的輔助診斷方法之一。

已有研究報(bào)道人體組織細(xì)胞中BNIP3基因異常甲基化與該基因沉默及胃腸腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［8］。但國內(nèi)尚未見腹腔沖洗液中游離細(xì)胞BNIP3基因異常甲基化與疾病進(jìn)展的研究報(bào)道。本研究顯示胃癌組織的BNIP3甲基化陽性率顯著高于癌旁組織，提示BNIP3基因甲基化與胃癌密切相關(guān)。分析其機(jī)制可能為［9，10］：（1）BNIP3 編碼產(chǎn)物含有凋亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于促凋亡家族成員，能與BCL-2，BCL-XL，EIB19k等抗凋亡蛋白相互作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。故BNIP3不表達(dá)或弱表達(dá)導(dǎo)致凋亡信號(hào)通路受阻，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。（2）DNA甲基化調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄水平（可在轉(zhuǎn)錄起始階段），即通過基因啟動(dòng)子及其附近區(qū)域內(nèi)CpG島胞嘧啶的甲基化關(guān)閉某種組織或細(xì)胞不必需的基因，如腫瘤抑制基因，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和浸潤基因等，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化的相關(guān)基因表達(dá)異常，造成細(xì)胞失去對(duì)正常過程的控制而發(fā)生惡變形成腫瘤。

本研究首次對(duì)胃癌患者腹腔沖洗液游離細(xì)胞BNIP3基因甲基化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果提示腹腔沖洗液BNIP3異常高甲基化與疾病進(jìn)展有關(guān)。

綜上所述，應(yīng)用MSP法檢測(cè)腹腔沖洗液游離細(xì)胞BNIP3基因甲基化可作為早期預(yù)測(cè)胃癌腹膜微轉(zhuǎn)移及評(píng)估疾病進(jìn)展的有效手段。若能將傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法與基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)，可為早期發(fā)現(xiàn)胃癌微轉(zhuǎn)移提供高敏感性、高特異性的輔助診斷，為評(píng)估患者的病情及選擇合理的治療方案提供科學(xué)依據(jù)。

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