李旸，廖愛軍，潘夢瑤，周蕾，徐淑梅，劉卓剛

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液病治療中心，沈陽 110004；2.遼寧省撫順市公安局監(jiān)管支隊(duì)，遼寧 撫順 113000）

齊墩果酸（oleanlic acid，OA）又名慶四素，屬五環(huán)三萜類化合物，是從木犀科植物齊墩果葉片中提取出的主要活性成分，在山楂、丁香、大棗中含量豐富。OA具有較多的生物學(xué)活性，其主要作用有抗腫瘤、保肝、降糖、降脂、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等。本研究以O(shè)A作用于人T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株，探討其對腫瘤細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)，并分析凋亡過程中活性氧（reactive oxygen species，ROS）和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（intracelluar Ca2+concentration，［Ca2+］i）的變化情況，為其抗T淋巴細(xì)胞白血病的新用途提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

OA、DMSO（美國 Sigma公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（天津澋洋生物制品有限公司），Annexin V/PI試劑盒（北京眾康志恒生物科技公司），MTT試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、鈣離子熒光探針、活性氧檢測試劑盒（均為上海碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 藥物配制與細(xì)胞培養(yǎng)

OA用二甲基亞砜（DMSO）稀釋成50 mmol/L，-20℃分裝保存，使用前解凍。Jurkat細(xì)胞由白求恩醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科惠贈。細(xì)胞懸浮生長于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞，以4×104/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板，100 μL/孔。OA處理組分別加入終濃度為 20，40，80，160 μmol/L 的 OA 稀釋液，每組均設(shè)3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)無藥對照組（OA，0 μmol/L）和空白組（不含有細(xì)胞的RPMI 1640培養(yǎng)基）。實(shí)驗(yàn)終止前4 h加入MTT，20 μL/孔，培養(yǎng)結(jié)束時，離心棄上清，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩器充分震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測定570 nm波長處吸光度（optical density，OD）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=［（對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）］×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測

分別用 40，80和160 μmol/L濃度的OA處理Jurkat細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞重懸于200 μL結(jié)合緩沖液中，加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，避光4℃反應(yīng)30 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)檢測，激發(fā)波長為488 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞周期分析

細(xì)胞處理方法同凋亡率檢測。離心棄上清，殘留約50 μL培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次。加入1 mL預(yù)冷70%乙醇中，吹打混勻，4℃固定過夜。再次收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌后，每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL碘化丙錠染色液（包括染色緩沖液、碘化丙錠染色液、RnaseA），充分重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光溫浴30 min，進(jìn)行流式檢測，用Cell-Modifit軟件分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中ROS含量

細(xì)胞處理方法同凋亡率檢測。各組細(xì)胞離心去上清，殘留約50 μL培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。加入1 mL 10 μmol/L DCFH-DA稀釋液重懸細(xì)胞，混勻后避光37℃孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次棄去未反應(yīng)的DCFH-DA，再次重懸細(xì)胞，使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長上流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞中［Ca2+］i測定

細(xì)胞處理方法同凋亡率檢測。各組細(xì)胞離心去上清，殘留約50 μL培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。加入1 mL 5 μmol/L Fluo-3AM鈣離子熒光探針稀釋液重懸細(xì)胞，混勻后避光37℃孵育30 min。離心棄去上清，1 mL無血清1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 OA對Jurkat細(xì)胞增殖的影響

320 μmol/L濃度范圍的OA均可使Jurkat細(xì)胞生存率下降，20 μmol/L OA對Jurkat細(xì)胞作用較輕微，而40 μmol/L以上濃度的OA對細(xì)胞的增殖抑制率明顯增高，呈時間和濃度依賴關(guān)系（表1）。

表1 OA作用于Jurkat細(xì)胞后的增殖抑制率（±s，%）Tab.1 The inhibitory effect of OA on proliferation of Jurkat cells（±s，%）

1）P<0.05，2）P<0.01 vs control.

Item Control 20 μmol/L 40 μmol/L 80 μmol/L 160 μmol/L 320 μmol/L 12 h 0 15.69±2.341） 41.01±5.132） 57.67±5.522） 60.72±6.571）） 73.33±3.811）24 h 0 25.47±6.541） 53.94±5.332） 61.98±1.821） 64.86±4.691） 79.10±1.852）48 h 0 39.82±4.522） 64.20±3.372） 69.86±5.761） 90.16±2.302） 92.09±1.211）

2.2 OA對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀測定結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞比例40 μmol/L 組［（19.8±1.59）%］、80 μmol/L 組［（29.39±0.64）%］、160 μmol/L 組［（34.72±0.94）%］，較對照組［（7.36±0.40）%］明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 OA對Jurkat細(xì)胞周期的影響

經(jīng)40 μmol/L OA處理24 h后，Jurkat細(xì)胞即出現(xiàn)G0/G1期阻滯，且隨藥物濃度逐漸增大，這種趨勢越來越明顯。80 μmol/L和160 μmol/L組的周期圖譜中可見亞G1期凋亡小峰，且凋亡小峰隨給藥濃度的增加有所增長。見圖1、表2。

表2 OA對Jurkat細(xì)胞周期的影響（±s，%）Tab.2 The effect of OA on the cell cycle of Jurkat cells（±s，%）

表2 OA對Jurkat細(xì)胞周期的影響（±s，%）Tab.2 The effect of OA on the cell cycle of Jurkat cells（±s，%）

1）P<0.05，2）P<0.01 vs control group.

Group G0/G1 G2/M S Control 54.26±1.43 3.25±0.02 42.49±1.42 40 μmol/L 85.83±0.912） 3.21±0.021） 10.96±0.922）80 μmol/L 91.18±1.322） 2.13±0.082） 6.69±1.342）160 μmol/L 92.90±1.192） 0.43±0.082） 6.67±1.222）

2.4 OA對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

流式檢測結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生隨給藥濃度的增加而升高。40 μmol/L濃度組與對照組比較差別不大，而80 μmol/L和160 μmol/L濃度組ROS水平明顯升高（P<0.05），見圖2。ROS的平均熒光強(qiáng)度與凋亡細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r=0.97，P<0.05）。

2.5 OA 對［Ca2+］i水平的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，40 μmol/L OA作用細(xì)胞24 h 后［Ca2+］i顯著提高，且［Ca2+］i隨給藥濃度增加而持續(xù)增加，呈劑量依賴性，160 μmol/L濃度組［Ca2+］i達(dá)到峰值，與對照組及其他濃度組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.01），見圖 3。［Ca2+］i的平均熒光強(qiáng)度與凋亡細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)（r=0.95，P<0.05）。

3 討論

OA作為一種天然萜類化合物，具有廣泛的生物學(xué)功能，近年來其抗腫瘤效應(yīng)越來越受到人們的關(guān)注。OA抗瘤譜廣，對肝癌、結(jié)腸癌、星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞均有生長抑制作用［1］。OA對白血病細(xì)胞株也有殺傷作用，主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［2］。其具體的機(jī)制是多方面的，目前研究認(rèn)為OA抗白血病效應(yīng)可能與Bax基因家族表達(dá)上調(diào)、Bcl-2基因家族表達(dá)下調(diào)、caspase蛋白家族活化、細(xì)胞色素C釋放增加、Fas參與的凋亡信號途徑激活等因素有關(guān)［2］。本研究選用白血病T淋巴細(xì)胞株為細(xì)胞模型，觀察OA對Jurkat細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果表明，OA對Jurkat細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用。經(jīng)Annexin V/PI雙染色后流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)OA能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生凋亡，這是OA處理后細(xì)胞存活率下降的主要原因。細(xì)胞周期分析進(jìn)一步表明在0～160 μmol/L濃度范圍內(nèi)，G0/G1期細(xì)胞比例隨OA濃度增加而增加，該結(jié)果說明OA對于Jurkat細(xì)胞株的作用有周期特異性，能使細(xì)胞生長停滯于G0/G1期。

ROS是真核細(xì)胞有氧呼吸的產(chǎn)物，包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（OH·）、過氧化氫（H2O2）等，因其含有不成對電子，具有較強(qiáng)的氧化能力。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在的巰基還原體系和抗氧化酶類能不斷清除細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的ROS，維持機(jī)體及細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。當(dāng)這種平衡狀態(tài)遭到破壞，ROS作為細(xì)胞有氧代謝的產(chǎn)物，首先具有一定的細(xì)胞毒性，能夠攻擊胞內(nèi)大分子，表現(xiàn)為脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和損傷DNA等有害效應(yīng)［3］。其次，ROS還是體內(nèi)重要的氧化還原信號分子，在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮重要的介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞內(nèi)ROS水平的輕微升高促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，而ROS的顯著增高則促發(fā)凋亡或壞死［4］。現(xiàn)有研究證明，阿霉素、三氧化二砷等多種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA片段化并引發(fā)凋亡作用都與ROS密切相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，80 μmol/L和160 μmol/L的OA作用于Jurkat細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中ROS水平升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且細(xì)胞凋亡率與ROS水平之間呈正相關(guān)（r=0.97）。由此推測，刺激細(xì)胞產(chǎn)生活性氧自由基而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是OA誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

對于凋亡的線粒體通路的研究已證實(shí)，在凋亡因子的刺激下，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（permeability transiton pore，MPTP）開放，線粒體跨膜電位降低或喪失，線粒體基質(zhì)中釋放出凋亡蛋白，促發(fā)細(xì)胞凋亡。Ca2+是細(xì)胞代謝活動重要的第二信使，也是使MPTP開放的刺激信號［5］，同時作為金屬輔助因子激活Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶而使DNA降解或激活轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)參與凋亡的基因表達(dá)。研究表明，細(xì)胞在凋亡早期即出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i迅速上升［6］，證實(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣超載與凋亡信號的啟動和傳導(dǎo)密切相關(guān)。另有研究也證實(shí)在納秒級陡脈沖誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡的過程中，細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+增高有可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路參與凋亡通路的調(diào)節(jié)［7］。而Ca2+拮抗劑可以通過阻斷鈣內(nèi)流、防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載對細(xì)胞起到保護(hù)作用［8］。本研究結(jié)果顯示，OA在誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平明顯升高，且與相同藥物濃度作用下細(xì)胞凋亡率的升高呈正相關(guān)（r=0.95），證明細(xì)胞內(nèi)鈣超載參與了OA誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡。

ROS和Ca2+均為細(xì)胞凋亡的早期信號，作用于線粒體，使線粒體通透性改變，跨膜電位降低，細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致凋亡。損傷的線粒體又釋放更多的ROS和Ca2+，進(jìn)一步加速凋亡。需要指出的是，ROS和鈣信號通路并非互相獨(dú)立，而是存在密切的交互作用。ROS可以反饋性調(diào)節(jié)［Ca2+］i，而［Ca2+］i升高又是線粒體代謝酶的直接刺激信號，能引起線粒體氧化呼吸鏈?zhǔn)芤?，ROS大量釋放［9］。本研究證明OA能誘導(dǎo)白血病T淋巴細(xì)胞Jurkat細(xì)胞株凋亡，凋亡過程中伴有ROS及游離Ca2+水平升高，且二者均與細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)，該結(jié)果提示OA與外源活性氧或Ca2+激動劑聯(lián)合應(yīng)用可能對臨床T淋巴細(xì)胞白血病的治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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