張洪開，徐韜鈞，具英花，于愛鳴

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽110001）

非小細(xì)胞肺癌 （non-small cell lung carcinoma，NSCLC）的發(fā)病率約占肺癌的80%～85%，其發(fā)生是多個(gè)原癌基因和抑癌基因參與的多基因、多步驟的過程，NSCLC的發(fā)生、發(fā)展受到細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK 等多條信號(hào)傳遞通路的調(diào)節(jié)［1，2］。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期失控及細(xì)胞凋亡機(jī)制異常密切相關(guān)，F(xiàn)OXO1作為1個(gè)抑癌基因，其蛋白可通過磷酸化水平的修飾對(duì)其下游多種靶基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，對(duì)細(xì)胞周期的阻滯、細(xì)胞凋亡發(fā)揮關(guān)鍵作用。在多種腫瘤中，PI3K/AKT和MAPK/ERK通路異常激活，導(dǎo)致FOXO1蛋白的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制［3］。文獻(xiàn)報(bào)道，MAPK通路和PI3K通路是傳遞細(xì)胞增殖信號(hào)的2個(gè)重要通路，2者之間存在一定程度的相互作用，而FOXO1蛋白正處于這2種信號(hào)途徑的共同交匯點(diǎn)，參與細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)節(jié)［2］。本研究擬探討人NSCLC中PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌A549細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，PI3K抑制劑LY294002和有絲分裂原活化蛋白激酶的激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK） 抑制劑UO126購(gòu)自 Cell Signaling公司，F(xiàn)OXO1抗體、p-FOXO1（s256） 抗體、Bim 抗體、p27kip抗體購(gòu)自Bioworld公司，兔抗人GAPDH抗體購(gòu)自ABmart公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，PI購(gòu)自Sigma公司，Annexin-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：將細(xì)胞接種于6孔板，于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后（細(xì)胞融合度約60%），血清饑餓 24 h，分別加入 25 μmol/L LY294002（LY294002 組）、10 μmol/L UO126（UO126組）、25 μmol/L LY294002+10 μmol/L UO126（聯(lián)合用藥組），由于本實(shí)驗(yàn)所用抑制劑的溶劑為DMSO，因此選擇等體積的DMSO為對(duì)照組，作用24 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 Western blot：冰上裂解 30 min，超聲破碎，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。取等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗過夜，洗滌，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL顯影并掃描測(cè)灰度值。GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)細(xì)胞周期：收集細(xì)胞，PBS吹打成單細(xì)胞懸液，70%乙醇溶液冰上固定2 h，PBS洗滌2次，加入PI染液（50 μg/mL PI，1 mg/mL RNase），室溫下避光孵育 30 min，F(xiàn)CM儀檢測(cè)。

1.2.4 Annexin-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)：收集細(xì)胞，PBS洗 2 次（1 000 r/min，離心 5 min），加入 500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入 5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL PI混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，F(xiàn)CM儀檢測(cè)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FOXO1及其靶蛋白表達(dá)的變化

Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，LY294002及UO126分別處理A549細(xì)胞24 h均可引起細(xì)胞中的p-FOXO1蛋白表達(dá)水平下降，Bim和p27kip表達(dá)水平升高，且聯(lián)合用藥組p-FOXO1進(jìn)一步下降，Bim和p27kip表達(dá)相應(yīng)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2種藥物單獨(dú)及聯(lián)合作用前后總的FOXO1表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖 1。

2.2 LY294002和UO126單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)程的影響

FCM結(jié)果顯示：用25 μmol/L LY294002和10 μmol/L UO126作用A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞周期進(jìn)程均被阻滯于G1期，且2種藥物聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞周期被阻滯在G1期的數(shù)量較單獨(dú)用藥時(shí)增多（對(duì)照組：69.35%±2.37%；LY294002 組：89.46%±2.15%；UO126組：88.46%±1.78%；聯(lián)合用藥組：97.65%±0.37%），而S期（對(duì)照組：18.09%±0.84%；LY294002組：3.95%±0.24%；UO126組：6.75%±0.25%；聯(lián)合用藥組：1.64%±0.19%）明顯減少，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.3 LY294002和UO126單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

25 μmol/L LY294002 和 10 μmol/L UO126 作用A549細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率增加（LY294002組：6.83%±1.79%；UO126組：5.92%±1.64%），較對(duì)照組（1.80%±0.41%）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率（14.10%±2.07%）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖3。

3 討論

PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)2條重要的促增殖和抗凋亡通路，其異常激活可通過影響下游細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白等效應(yīng)分子的活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期的失控和細(xì)胞凋亡異常，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用［4～6］。

研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路均可調(diào)節(jié)FOXO1轉(zhuǎn)錄因子的活性。在這2條信號(hào)通路異常激活的作用下，F(xiàn)OXO1蛋白分子中的保守性位點(diǎn)發(fā)生磷酸化并從胞核輸出，與14-3-3蛋白在胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合，從而封閉了自身的核定位序列并定位于胞質(zhì)中，遠(yuǎn)離了其自身的靶基因，從而抑制了FOXO1因子對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［7］，并通過調(diào)節(jié)下游細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)信號(hào)分子FasL、Bim、p27kip、cyclinE、cyclinB等，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程和凋亡事件［8～11］。人NSCLC中PI3K/AkT和MAPK/ERK信號(hào)通路通過FOXO1轉(zhuǎn)錄因子共同對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：分別阻斷這2條通路可使FOXO1蛋白的磷酸化水平降低，并使其從胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位，從而影響FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞的增殖。

本研究應(yīng)用PI3K/AkT和MAPK/ERK信號(hào)通路特異性抑制劑單獨(dú)及聯(lián)合處理人NSCLC A549細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示，選用抑制劑LY294002和UO126分別和同時(shí)作用A549細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，F(xiàn)OXO1總的蛋白水平?jīng)]有顯著的變化，但磷酸化水平降低，我們推測(cè)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并非調(diào)節(jié)FOXO1總的蛋白水平，而是通過改變FOXO1因子的磷酸化狀態(tài)影響其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞的增殖。FOXO1因子的磷酸化水平降低的同時(shí)，其靶基因p27kip和Bim的蛋白表達(dá)水平均表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，進(jìn)一步證實(shí)PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路特異性抑制劑均能夠增強(qiáng)FOXO1因子的轉(zhuǎn)錄活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在A549細(xì)胞中，PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路可以通過增高FOXO1蛋白磷酸化水平，改變FOXO1蛋白的亞細(xì)胞定位，進(jìn)而抑制FOXO1因子的轉(zhuǎn)錄活性，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞存活，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。有文獻(xiàn)提出：這2條信號(hào)通路對(duì)FOXO1有著相同的磷酸化調(diào)節(jié)位點(diǎn)，如胰島素可以通過激活A(yù)kt和MAPK通路使FOXO1的S253位點(diǎn)磷酸化［12］。對(duì)于PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路共同對(duì)該位點(diǎn)的調(diào)節(jié)具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。本研究中，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示：分別加入LY294002和UO126組都可以抑制細(xì)胞的增殖，引起G1/S期的阻滯，且2種藥物共同作用時(shí)，對(duì)細(xì)胞G1期的阻滯效果更加明顯。FCM分析顯示：與對(duì)照組相比，LY294002和UO126都可干預(yù)A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率呈現(xiàn)較小程度的增加，但2種抑制劑聯(lián)合作用組細(xì)胞凋亡率明顯高于單藥實(shí)驗(yàn)組。表明分別阻斷PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路后，都可以通過調(diào)控FOXO1轉(zhuǎn)錄因子的活性，引起A549細(xì)胞周期的阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，且2條信號(hào)通路同時(shí)阻斷后效果更加明顯。

綜上所述，阻斷PI3K/Akt和MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路可通過調(diào)控FOXO1轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞的凋亡，且這2條通路具有一定的協(xié)調(diào)作用。

［1］Addario GD，F(xiàn)rüh M，Reck M，et al.Metastatic non-small-cell lung cancer：ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis，treatment and follow-up［J］.Ann Oncol，2010，21（5）：116-119.

［2］RoySK，SrivastavaRK，ShankarS.InhibitionofPI3K/AKTand MAPK/ERK pathways causes activation of FOXO transcription factor，leadingtocellcyclearrestandapoptosisinpancreaticcancer［J］.J Mol Signal，2010，5：10.

［3］Shankar S，Chen Q，Srivastava RK，et al.Inhibition of PI3K/Akt and MEK/ERK pathways act synergistically to enhance antiangiogenic effects of EGCG through activation of FOXO transcription factor［J］.J Mol Signal，2008，3：7.

［4］周振琪，王恬，石放雄.FOXO轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期和凋亡［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2007，29（2）：187-190.

［5］Chen PN，Hsieh YS，Chiang CL，et al.Silibinin inhibits invasion of oral cancer cells by suppressing the MAPK pathway［J］.J Dent Res，2006，85（3）：220-225.

［6］Hill K，Welti S，Yu J，et al.Specific requirement for the p85-p110 alpha phosphatidylinositol 3-kinase during epidermal growth factorstimulated actin nucleation in breast cancer cells［J］.J Biol Chem，2000，275（6）：3741-3744.

［7］Obsilova V，Vecer J，Herman P，et al.14-3-3 Protein interacts with nuclear localization sequence of forkhead transcription factor FoxO4［J］.Biochemistry，2005，44（34）：11608-11617.

［8］Ramjaun AR，Tomlinson S，Eddaoudi A，et al.Upregulation of two BH3-only proteins，Bmf and Bim，duing TGF beta-induced apotosis［J］.Oncogene，2007，26（7）：970-981.

［9］Kuiperij HB，Van der Horst A，Raaijmakers J.Activation of Foxo transcription factors contributes contributes to the antiproliferative effect of cAMP［J］.Oncogene，2005，24（12）：2087-2095.

［10］Weidinger C，Krause K，Klajje A，et al.Forkhead box-O transcription factor：critical conductors of cancer′s fate ［J］.Endocr Relat Cancer，2008，15（4）：917-929.

［11］Gilley J，Coffer PJ，Ham J，et al.FOXO transcription factors directly activate bimgene expression and promote apoptosis in sympathetic neurons［J］.Cell Biol，2003，l62（4）：613-622.

［12］Naimi M，Gautier N，Chaussade C，et al.Nuclear Foxol controls and integrates key signaling pathways in hepatocytes［J］.Endocrinology，2007，148（5）：2424-2434.