趙潤英，郝偉，孟祥軍，趙麗妮，李昭，魏巍

（沈陽醫(yī)學(xué)院1.藥理教研室；2.機能實驗中心；3.藥物化學(xué)教研室；4.沈陽博潤生物技術(shù)有限公司，沈陽 110034）

近年來，血小板白細胞聚集體（platelet-leukocyte aggregates，PLA）作為一種影響血栓形成的重要因素，正逐漸引起國內(nèi)外心腦血管病專家的重視［1］。研究PLA的發(fā)生機制和尋找PLA形成的抑制藥物，對缺血性心腦血管疾病的預(yù)防與治療具有深遠的意義。阿魏酸川芎嗪（ligustrazine ferulic，LF）是以活血化瘀中藥川芎的有效成分——LF結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)合成的阿魏酸鹽類化合物，已被證實其具有抗ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用［2］，且作用強于川芎嗪。本實驗初步評價LF抗血栓形成作用，并通過LF對血小板P-選擇素表達和對血小板與中性粒細胞黏附的影響，進一步探討其抗血栓形成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250～300 g，沈陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 儀器：SEN-7203型三道電子刺激器（日本NihonKodehn公司）；DVM-4200型超聲血液流量計（日本Hayashi Denki公司）；LBY-NJ4型血小板聚集儀（北京普利生公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國Becton-Dickinson公司）。

1.1.3 藥品與試劑：LF（沈陽醫(yī)學(xué)院藥研中心）：臨用前用TMP助溶劑和注射用水溶解后制成4%、8%、16%的溶液；硫酸氫氯吡格雷（clopidogrel sul－fate，CS，湖北海柏元化工有限公司）：臨用前用注射用水溶解后制成1.3%的溶液；TMP助溶劑（濟南慧萌生物科技公司）；凝血酶（thrombin，美國Sigma公司）；異硫氰酸熒光素標記的血小板P-選擇素單克隆抗體（CD62P-FITC，美國Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥：50只雄性SD大鼠隨機分成生理鹽水對照組（NS組）、硫酸氫氯吡格雷8 mg·kg-1陽性對照組（CS組）、阿魏酸川芎嗪 4 mg·kg-1低劑量組（LF1組），阿魏酸川芎嗪8 mg·kg-1高劑量組（LF2組），阿魏酸川芎嗪4 mg·kg-1+硫酸氫氯吡格雷4 mg·kg-1組（LF+CS組），每組10只。

1.2.2 動脈血栓形成實驗：參照魏偉主編《藥理實驗方法學(xué)》的方法［3］。

1.2.2.1 電刺激頸動脈血栓形成 利用電刺激，破壞局部血管，使血管內(nèi)皮損傷，促使血小板黏附聚集從而形成血栓。大鼠用20%烏拉坦50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，分離左頸總動脈和左股靜脈。左股靜脈置管按1 mL·kg-1體質(zhì)量注射給藥，給藥后15 min，左頸總動脈置2根銀制電極，超聲探針置近頭端，用電刺激器以1.5 mA的直流連續(xù)刺激大鼠頸動脈7 min，用超聲血流量儀記錄血栓形成時間（即從刺激開始至頸動脈血流量為“零”的時間，thrombosis time，TT）。觀察刺激開始后60 min內(nèi)的血流量變化，如血管仍未栓塞，則以60 min作為最大TT。

1.2.2.2 動靜脈旁路血栓形成 大鼠用20%烏拉坦50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，分離右頸總動脈和左頸外靜脈。在聚乙烯管的中段放入一根長6 cm的絲線，以肝素-生理鹽水溶液（50 U·kg-1）充滿聚乙烯管，當(dāng)聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后由聚乙烯管準確的注入肝素（50 U·kg-1）抗凝，然后再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈。打開動脈夾，血液從右頸總動脈流至聚乙烯管，返回左頸外靜脈。先于頸外靜脈按1 mL·kg-1體質(zhì)量注射對照藥和受試藥，2 min內(nèi)注完。20 min后制作血栓模型，并開放血流15 min后，中斷血流，迅速取出絲線稱重，總質(zhì)量減去絲線質(zhì)量即得血栓濕重（waterish thrombus weight，WTW）。計算各藥的血栓形成抑制率（thrombosis inhibition ratio，TIR）。

TIR=［（空白組血栓質(zhì)量-給藥組血栓質(zhì)量/空白組血栓質(zhì)量）］×100%。

1.2.3 血小板中性粒細胞黏附實驗

1.2.3.1 標本采集 頸動脈取血，收集于一次性含肝素抗凝劑塑料離心管中。取血量與抗凝劑的比例為9∶1，立即顛倒充分混勻。

1.2.3.2 洗滌血小板的制備［4］抗凝血標本用水平離心機600 r/min離心5 min，小心吸取上層富含血小板血漿（platelet-richplasma，PRP）。PRP以1000r/min離心10 min獲得濃縮血小板，用0.9%的生理鹽水對濃縮血小板進行3次洗滌，并懸浮于0.9%的生理鹽水中，計數(shù)其血小板數(shù)量，并調(diào)整血小板密度為200×109/L；取細胞液涂片，用臺盼藍拒染試驗和Giemsa染色，鑒定其存活率>95%。

1.2.3.3 中性粒細胞（po1ymorphoneuc1ear 1eucocyte，PMN）的制備 在上述吸出PRP后的抗凝血中，加入與PRP等體積的生理鹽水和1/6體積的6%右旋糖酐（Dextran T 500）混勻。37℃靜置30 min，沉淀紅細胞。將上層白細胞吸出輕浮于3 mL淋巴細胞分離液中，500 r/min離心30 min；取出底部中性粒細胞，加入1 mL雙蒸水溶血30 s，使紅細胞破膜，再加2倍濃度的PBS 1 mL，然后離心10 min，中性粒細胞團塊用PBS洗3次，最后懸浮于2～3 mL 0.1%白明膠Hank’s液中 （溶媒組胞外含l mmoL/L CaCl2或5 mmol/L EGTA分別反應(yīng)有鈣或無鈣的情況）。調(diào)整細胞密度為200×109/L；取細胞液涂片，用臺盼藍拒染試驗和Giemsa染色，鑒定其存活率>95%。

1.2.3.4 玫瑰花結(jié)試驗 采用改良Hamburger方法［5］，取 50 μL 血小板與凝血酶（0.2 U/mL）37 ℃ 溫育15 min，然后分別加溶媒（menstruum）或不同濃度的藥物各50 μL，繼續(xù)靜置15 min，再加入中性粒細胞懸液100 μL，于4℃振蕩30 min。取出少許細胞懸液，在常規(guī)計數(shù)板上于40倍鏡下隨機計數(shù)100個中性粒細胞，其周圍黏附有2個或2個以上血小板者為玫瑰花結(jié)試驗陽性。每樣本計數(shù)3次，取其均值，計算玫瑰花結(jié)形成百分率（黏附率，adherence rate，AR）和黏附抑制率（adherence inhibition ratio，AIR），并求出 IC50。

AIR=［（溶媒管黏附率-給藥管黏附率）/溶媒管黏附率］×100%

1.2.4 血小板P-選擇素的測定：采用流式細胞技術(shù)法測定血小板P-選擇素表達的陽性率。大鼠靜脈血以5%枸櫞酸鈉抗凝（抗凝劑∶血=1∶9），以800r/min離心 5～10 min，取富含血小板的血漿（PRP），制成血小板懸液，取100 μL血小板懸液分別加入試管，并加入CD62P-FITC，不加CD62P-FITC的試管為陰性對照，室溫避光反應(yīng)30 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液漂洗2次后上機檢測，收集10 000個血小板，血小板P-選擇素表達陽性率由帶熒光的異硫氰酸鹽標記的血小板百分數(shù)確定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LF對電刺激大鼠頸動脈法血栓形成的影響

與CS陽性對照組比較，血栓形成時間CS+LF組較長，LF1組較短（P＜0.01），均有顯著性差異；而LF2組血栓形成時間略短，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。NS空白對照組的血栓形成時間明顯短于CS陽性對照組，有顯著性差異（P＜0.01）。見表1。

表1 LF對電刺激大鼠頸動脈法和動靜脈旁路法血栓形成的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of ligustrazine ferulate on electrically stimulated carotid thrombosis and bypass thrombosis between carotid and jugular vein in rats（±s，n=10）

表1 LF對電刺激大鼠頸動脈法和動靜脈旁路法血栓形成的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of ligustrazine ferulate on electrically stimulated carotid thrombosis and bypass thrombosis between carotid and jugular vein in rats（±s，n=10）

Compared with NS group：1）P ＜ 0.01；compared with CS group：2）P ＜ 0.05.

Group Dose（mg·kg-1） WTW（mg） TIR（%） TT（min）NS - 20.43±6.681） - 18.1±2.41）CS 8 12.16±5.94 40.5 32.9±3.6 LF1 4 17.71±8.321） 13.3 27.1±2.01）LF2 8 13.55±5.13 33.7 30.8±5.1 LF+CS 4+4 10.12±4.261） 49.5 36.5±3.91）

2.2 LF對大鼠動靜脈旁路法血栓形成的影響

與CS陽性對照組比較，CS+LF組血栓濕質(zhì)量較輕，血栓抑制率較高，LF1組血栓濕質(zhì)量較大，血栓抑制率較低，有顯著性差異（P＜0.01）；而LF2組血栓濕質(zhì)量略重，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。NS空白對照組血栓濕質(zhì)量明顯高于CS陽性對照組，有顯著性差異（P＜0.01）。見表1。

2.3 LF對大鼠血小板P-選擇素的影響

血小板P-選擇素在NS空白對照組和LF1組的表達較多，在CS+LF組的表達較少（P＜0.01），與CS陽性對照組比較，有顯著性差異。LF高劑量組的血小板P-選擇素的表達略高于CS陽性對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.4 LF對大鼠血小板與中性粒細胞黏附的影響

胞外存在1 mmol·L-1的CaCl2時，溶媒組用凝血酶激活的血小板與中性粒細胞之間形成的玫瑰花結(jié)為（71.2±5.9）%。與溶媒組比較，不同濃度的LF、CS和LF+CS組的黏附率均顯著降低，黏附抑制率顯著提高，有顯著性差異（P＜0.01）；對應(yīng)濃度的LF組指標低于CS組，有顯著性差異（P＜0.05）；對應(yīng)濃度的LF+CS組指標高于CS和LF組（P＜0.01）。見表 2。LF，CS 和 CS+LF 的 IC50分別為 64.3 μmol·L-1、62.5 μmol·L-1和 59.8 μmol·L-1。

3 討論

不穩(wěn)定心絞痛、急性心肌梗死、缺血性腦卒中等急性心腦血管疾病具有極高的致死率或致殘率，其主要病理基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）。近年來研究表明，PLA在動脈粥樣硬化性血栓形成性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［5］。PLA是血小板活化的敏感指標［6］，血小板活化后，血小板膜表面的 P-選擇素（P selectin）和糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）的表達增加，血小板通過P-選擇素與白細胞膜表面的P-選擇素配體糖蛋白1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）的結(jié)合而與白細胞黏附形成PLA。此外，血小板表面的GPⅡb/Ⅲa和白細胞表面的黏附受體Mac-1（CD11b/CD18）分別與纖維蛋白原結(jié)合，通過纖維蛋白原的橋接作用形成PLA［7］。但P-選擇素與PSGL-l相互作用是PLA形成的主要途徑［8］。P-選擇素即CD62p，是一種分子質(zhì)量約為140 kDa的跨膜糖蛋白，通常儲存于血小板的α顆粒和內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade小體中。PSGL-l也是一種跨膜糖蛋白，主要表達在白細胞的微絨毛體上，是惟一與P-選擇素具有高度親和力的配體。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血小板或內(nèi)皮細胞受凝血酶、組胺、腫瘤壞死因子等刺激而活化后，α顆粒和Weibel-Palade小體膜、胞膜迅速融合，使儲存的P-選擇素在細胞表面快速表達并與PSGL-1結(jié)合，從而介導(dǎo)活化的內(nèi)皮細胞和血小板與中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等相互作用，且這種作用是通過鈣離子的參與來調(diào)節(jié)的［9，10］。目前認為 PLA 的作用主要有：（1）促進白細胞在血管損傷處聚集以及參與隨后的血管內(nèi)膜增生；（2）參與動脈粥樣硬化不穩(wěn)定性；（3）增加組織因子介導(dǎo)的凝血酶產(chǎn)生；（4）在缺血/再灌注過程中形成小血栓阻塞微血管；（5）促進各種細胞因子、血管活性物質(zhì)的釋放；（6）影響血小板和白細胞的功能等。PLA作為血小板活化的敏感指標，在臨床上已經(jīng)成為急性冠脈綜合征和冠脈介入手術(shù)抗血小板治療中的新興研究靶點［11］，阻斷P-選擇素有望成為穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊及防治急性心腦血管疾病的有效治療手段。本研究發(fā)現(xiàn)，LF能夠明顯降低由凝血酶激活的血小板與中性粒細胞的黏附率、明顯延長電刺激頸動脈法的血栓形成時間和減輕動靜脈旁路法的血栓濕質(zhì)量，提示其具有較強的抗血栓形成作用；其機制可能與LF抑制血小板的活化，降低大鼠血小板P-選擇素的表達，從而減少血小板通過P-選擇素與白細胞表面的PSGL-1結(jié)合，減少PLA的形成有關(guān)。但LF是否能夠阻斷P-選擇素與PSGL-1的結(jié)合，從而抑制PLA的形成尚有待進一步的研究。

表2 LF對凝血酶激活的大鼠血小板與中性粒細胞間黏附的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of ligustrazine ferulate on platelet-neutrophil adhesion by means of thrombin activation in rats（±s，n=10）

表2 LF對凝血酶激活的大鼠血小板與中性粒細胞間黏附的影響（±s，n=10）Tab.2 Effect of ligustrazine ferulate on platelet-neutrophil adhesion by means of thrombin activation in rats（±s，n=10）

Adherence rate of menstruumgroup：（71.2±5.9）%；1）compared with menstruumgroup，P ＜ 0.01；2）compared with LF group，P ＜ 0.05；3）compared with CS group，P ＜ 0.05.

Drug LF CS LF+CS concentration AR AIR AR AIR AR AIR（μmol/L） （%） （%） （%） （%） （%） （%）0.00 69.5±4.9 2.4 68.8±8.1 3.4 69.1±5.9 2.9 18.75 45.2±5.11） 36.5 40.2±2.91），2） 43.5 37.4±3.11），2），3） 47.5 37.50 37.8±4.61） 46.9 32.5±4.11），2） 54.4 28.6±4.51），2），3） 59.8 75.00 30.4±4.71） 57.3 26.1±2.41），2） 63.3 23.8±2.81），2），3） 66.6 150.00 24.6±5.51） 65.4 20.4±5.21），2） 71.3 18.2±3.51），2），3） 74.4 300.00 19.3±3.21） 72.9 17.1±3.11），2） 76.0 15.2±2.21），2），3） 78.7

硫酸氫氯吡格雷作為ADP受體拮抗劑，對PLA的形成有明顯的抑制作用［12，13］，臨床主要用于心肌梗死、缺血性腦卒中和急性冠脈綜合征的治療。本研究表明低劑量LF的抗血栓作用弱于硫酸氫氯吡格雷，高劑量LF的抗血栓作用與硫酸氫氯吡格雷相當(dāng)，而二者劑量減半后合用則具有明顯的協(xié)同作用效果。因此，本試驗為LF應(yīng)用于治療急性心腦血管疾病提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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