韓冬，孫淼，張碩，張鴻，馮娟

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004）

缺血性腦卒中是臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病，目前臨床已開(kāi)展溶栓治療和動(dòng)脈介入治療使閉塞的腦動(dòng)脈再通，但血管再通后再灌注會(huì)加重組織細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞，即再灌注損傷［1］。如何尋找有效的方法減輕再灌注損傷是臨床上治療腦梗死的關(guān)鍵。最近研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理能夠能減輕缺血再灌注損傷，是一種有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，已成為腦保護(hù)研究的熱點(diǎn)。腦缺血后處理［2］是指在缺血再灌注后一定時(shí)間內(nèi)，給予1次或多次短暫性缺血再灌注，使腦組織對(duì)前面較長(zhǎng)時(shí)間的缺血產(chǎn)生耐受性。本實(shí)驗(yàn)采用大腦中動(dòng)脈線拴法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，研究缺血后處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注后的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性清潔級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量250～280 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組（I/R組）和缺血后處理組（IP組），每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型：采用Longa法［3］制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)前12 h禁食，不禁水。術(shù)前稱重，按0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后，取正中右旁開(kāi)0.5 cm作縱行切口。在顯微鏡下分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈，暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈阻斷血流，用眼科剪在頸外動(dòng)脈殘端血管壁上剪一小口，將準(zhǔn)備好的栓線（頭端直徑0.28 mm，購(gòu)自北京沙東生物技術(shù)有限公司）插入頸外動(dòng)脈，繼續(xù)進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)遇到輕微阻力時(shí)停止，結(jié)扎栓線根部絲線。栓線插入深度為18～20 mm，其頭端恰好位于大腦中動(dòng)脈起始處，阻斷了該動(dòng)脈的血流。將多余的栓線剪去，將其尾端置于正中切口皮下，縫合切口。假手術(shù)組栓線插入深度為10 mm，使栓線頭端停留于頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)而不進(jìn)入大腦中動(dòng)脈內(nèi)。缺血120 min再灌注時(shí)，將大鼠再次麻醉，剪開(kāi)切口縫合線，在手術(shù)顯微鏡下部分抽出栓線，將栓線抽出5 mm，此時(shí)大腦中動(dòng)脈血流再通。術(shù)中用電熱毯及電烤燈保持大鼠肛溫在36～37℃，術(shù)后分籠飼養(yǎng)，24 h后取材。

1.2.2 缺血后處理：在缺血120 min再灌注開(kāi)始前拔出5 mm栓線，使血管再通30 s，然后再將栓線插入5 mm，阻斷血流30 s，如此進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，進(jìn)行缺血后處理。之后拔出栓線實(shí)現(xiàn)永久再灌注。

1.3 神經(jīng)功能缺失評(píng)分

參照文獻(xiàn)［3］的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，對(duì)側(cè)前爪不能完全伸直；2分，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，站立不穩(wěn)，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。術(shù)后約1 h動(dòng)物可蘇醒，觀察神經(jīng)功能缺失情況。累計(jì)1分以上即為成功模型。

1.4 腦梗體死積測(cè)定

TTC染色：腦切成2 mm厚，放于2%TTC染液中，37℃溫育15 min。正常腦細(xì)胞染成橘紅色，梗死區(qū)不著色，用圖像處理軟件Photoshop 5.0計(jì)算梗死面積（橘紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)）、各腦片梗死面積之和乘以厚度（2 mm）為總的梗死容積。梗死體積百分率=（正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織體積）/正常側(cè)大腦半球體積×100%。

1.5 電鏡切片的制備和觀察

大鼠腦缺血再灌注24 h后迅速斷頭取腦，取1 mm×1 mm×1 mm大小的新鮮腦組織，放入2.5%戊二醛中浸泡固定，2%四氧化鋨后固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂618包埋、超薄切片經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色后，在80 kV條件下用JEM-1200EX型透射電鏡觀察結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 缺血后處理對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分的影響

除假手術(shù)組外，各組動(dòng)物清醒后出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，向患側(cè)轉(zhuǎn)圈、傾倒，不能站立、不能行走。I/R組和IP組神經(jīng)功能缺損評(píng)分分別為2.50±0.55和1.33±0.52，IP組神經(jīng)功能缺損較I/R組減輕，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 缺血后處理對(duì)大鼠梗死體積的影響

TTC染色結(jié)果顯示，I/R組和IP組右側(cè)大腦半球可見(jiàn)腦梗死灶，I/R組和IP組梗死體積百分比分別為29.98%±8.08%和17.06%±1.85%，IP組梗死體積百分比明顯小于I/R組（P<0.01）。

2.3 缺血后處理對(duì)大鼠神經(jīng)元及其髓鞘變化的影響

正常神經(jīng)元（圖1A）核膜光滑，核仁清楚，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有豐富線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體等細(xì)胞器；髓鞘結(jié)構(gòu)（圖1D）正常，包繞軸突。I/R組缺血再灌注后神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改變（圖1B），核膜模糊，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體嵴減少，線粒體外膜破損，線粒體空泡變性，細(xì)胞器減少、破壞；髓鞘（圖1E）板層分離（箭頭所示），髓鞘厚度變薄。IP組神經(jīng)元（圖1C）及髓鞘（圖1F）結(jié)構(gòu)改變介于二者之間。

3 討論

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)缺血后處理對(duì)缺血再灌注損傷具有較強(qiáng)的內(nèi)源性保護(hù)作用。2003年Zhao等［4］在犬的心肌缺血再灌注研究中發(fā)現(xiàn)，缺血后再灌注開(kāi)始時(shí)，給予連續(xù)3次、每次30 s、再灌注30 s缺血的處理，可以減輕再灌注損傷。2006年Zhao等［5］發(fā)現(xiàn)缺血后處理同樣具有腦保護(hù)作用，能夠縮小腦梗死體積，減少神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。缺血后處理是一種缺氧耐受現(xiàn)象，具有很強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用。

神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，其對(duì)于缺血缺氧的耐受性差，在腦缺血再灌注發(fā)生后出現(xiàn)損傷，發(fā)生壞死，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失。神經(jīng)髓鞘是包裹在神經(jīng)細(xì)胞軸突外面的管狀外膜，呈層狀包繞軸突，具有絕緣作用并提高神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)速度，具有保護(hù)軸突的作用。在缺血再灌注后同樣出現(xiàn)損害，出現(xiàn)髓鞘剝脫等改變。所以，如何保護(hù)神經(jīng)元及其髓鞘、減少再灌注損傷是缺血再灌注后神經(jīng)保護(hù)的重點(diǎn)。

細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)是反映細(xì)胞損傷程度最直觀的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用透射電鏡技術(shù)觀察神經(jīng)元及包繞其軸突的髓鞘改變，結(jié)果顯示缺血再灌注可導(dǎo)致神經(jīng)元、髓鞘不同程度損傷，IP組的損傷程度較I/R組減輕。缺血后處理減輕大腦皮層區(qū)神經(jīng)元胞體、基底節(jié)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞髓鞘損傷，說(shuō)明缺血后處理對(duì)神經(jīng)元具有明顯保護(hù)作用。以往報(bào)道多數(shù)關(guān)注神經(jīng)元細(xì)胞胞體改變，而對(duì)髓鞘關(guān)注不多，髓鞘作為神經(jīng)元細(xì)胞的一部分、腦白質(zhì)的重要成分，在神經(jīng)信號(hào)傳遞中有重要作用，在缺血再灌注過(guò)程中同樣受到缺血再灌注損傷，其損害可破壞神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)，出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀，從而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的整體功能造成嚴(yán)重影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后基底節(jié)區(qū)髓鞘層狀脫失，結(jié)構(gòu)破壞，可導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳遞障礙，而IP組髓鞘情況明顯好于I/R組，說(shuō)明缺血后處理可以保護(hù)缺血后處理的神經(jīng)細(xì)胞髓鞘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，大鼠缺血再灌注24 h IP組梗死體積及神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果好于 I/R 組，宮利、張慧等［6，7］也有類似報(bào)道。證實(shí)IP能夠減小缺血再灌注后梗死體積，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。所以，無(wú)論從微觀神經(jīng)細(xì)胞觀察到宏觀大體腦梗死體積測(cè)定，還是從解剖學(xué)結(jié)構(gòu)到行為學(xué)神經(jīng)功能評(píng)分，缺血后處理均能減輕再灌注損傷，表明IP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

而到目前為止，缺血后處理的腦保護(hù)機(jī)制還不是完全清楚。研究表明缺血后處理的腦保護(hù)作用可能與細(xì)胞凋亡［8］、炎癥［9］、蛋白激酶途徑［10］、PI3K/Akt途徑［11］、MAPK 途徑［12］、線粒體滲透性轉(zhuǎn)化孔開(kāi)放［13］、線粒體ATP敏感性鉀通道開(kāi)放［14］等有關(guān)。

綜上所述，缺血后處理對(duì)于神經(jīng)元及其髓鞘具有保護(hù)作用，能夠減輕梗死體積，改善神經(jīng)功能損傷。因?yàn)槿毖筇幚頃r(shí)機(jī)易于掌握、干預(yù)過(guò)程簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)，對(duì)于腦梗死早期溶栓或栓子自溶血管再通后再灌注損害具有一定的保護(hù)作用，所以在未來(lái)一定具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，為臨床腦保護(hù)提出新的研究方向。

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