任路平，宋光耀，霍麗靜，劉娜，陳樹(shù)春

（河北省人民醫(yī)院1.內(nèi)分泌科；2.檢驗(yàn)科，石家莊 050051）

近年來(lái)，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率逐年升高，膳食因素中糖的過(guò)量攝入可促進(jìn)脂肪肝發(fā)生發(fā)展［1］，NAFLD具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究表明可能與肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等有關(guān)［2］，目前尚缺乏有效治療NAFLD的藥物。

氧化苦參堿是苦參堿類(lèi)生物堿之一，常用于治療慢性肝炎，既往研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可降低實(shí)驗(yàn)性大鼠脂肪肝的肝損傷［3］，但具體機(jī)制尚未闡明。本研究應(yīng)用氧化苦參堿干預(yù)慢性高果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)的大鼠脂肪肝，觀察氧化苦參堿對(duì)大鼠胰島素抵抗和肝臟脂質(zhì)沉積影響；觀察高果糖喂養(yǎng)和氧化苦參堿干預(yù)對(duì)肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）標(biāo)志物的影響，旨在探討高果糖攝入引起脂肪肝的機(jī)制及氧化苦參堿改善脂肪肝的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性Wistar大鼠由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照隨機(jī)分組的原則分為對(duì)照組、高果糖組和氧化苦參堿組，每組大鼠為15～16只，體質(zhì)量250～280 g，對(duì)照組進(jìn)食普通飼料；果糖組果糖占總熱量34.5%，高果糖飼料配方參考文獻(xiàn)［4］，具體為：果糖34.5%，淀粉34.5%，脂肪9%，蛋白質(zhì)21%；喂養(yǎng)4周后，氧化苦參堿組每日灌胃給予氧化苦參堿（苦參素膠囊，江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，40 mg/kg）；3組每日進(jìn)食熱量基本相等，喂養(yǎng)16周后處死大鼠，采血測(cè)定相關(guān)指標(biāo)及肝總質(zhì)量，留取肝組織。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定：各組大鼠喂養(yǎng)16周后禁食10 h，采用快速血糖測(cè)定儀測(cè)定空腹血糖（FBG）；頸動(dòng)脈取血，分離血清，用放射免疫法測(cè)定空腹血胰島素（FINS）；HOMA 胰島素抵抗指數(shù)（HOMA index of insulin resistance，HOMA-IR）計(jì)算方法：HOMA-IR=空腹血糖（mmol·L-1）×空腹胰島素（μIU·mL-1）/22.5。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）。

1.2.2 肝臟甘油三酯（TG）測(cè)定：取肝臟組織30 mg經(jīng)氯仿/甲醇抽提甘油三酯后，加入0.6%NaCl分離水相和有機(jī)相，吸取有機(jī)相待干燥后溶于100%乙醇 （500 μL），應(yīng)用 GPO-PAP 試劑盒（boehringer mannheim，Germany）測(cè)定 TG 含量。

1.2.3肝臟病理變化檢查——油紅O染色步驟：新鮮肝組織冰凍切片7 μm，風(fēng)干載玻片30 min，10%中性甲醛中固定10～15 min，然后水洗；置于密封容器盛裝的脂肪染色劑內(nèi)（稀釋后的油紅染液）10～15 min；用60%乙醇分色、水洗；蘇木精淡染核30 s，1%磷酸氫二鈉沖洗至變藍(lán)；稍干后甘油明膠封固。

1.2.4 肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子標(biāo)志物基因表達(dá)測(cè)定：采用Trizon提取組織總RNA，采用SYBR Green實(shí)時(shí)檢測(cè)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子標(biāo)志物糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein，GRP78）和 C/EBP 同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）基因的表達(dá)（PE9600熒光定量?jī)x，美國(guó) Perkin Elmer）［5］。PCR 體系 50 μL，5×SYBR Green10 μL，2 U/μLTaq 酶 1.5 μL，25 mmoL/L 脫氧核苷三磷酸 0.5 μL，10 μmoL/L 上游引物 10 μmoL/L下游引物 1 μL，cDNA 模板 5 μL，雙蒸水 30 μL。于循環(huán)延伸反應(yīng)最后時(shí)刻收集熒光信號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：10倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，各取2.5 μL做定量模板，反應(yīng)體系及條件同上，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。以稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，循環(huán)域值（Ct）為縱坐標(biāo)，軟件分析系統(tǒng)可自動(dòng)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到相應(yīng)各待測(cè)樣本的值和起始拷貝數(shù)。每組隨即選取6只小鼠進(jìn)行基因檢測(cè)。GRP78基因檢測(cè)引物序列：上游5′-AGGACAAGAAGGAGGATGTGGG-3′，下游 5′ACCG AAGGGTCATTCCAAGTG-3′；CHOP 基因檢測(cè)引物序列：上游 5′-TTCACTACTCTTGACCCTGCGTC-3′，下游 5′-CACTGACCACTCTGTTTCCGTTTC-3′。 內(nèi)參GAPDH的引物序列：上游5′-CATCACCATCTTCC AGGAGCG-3′，下游：5′-TCACCTTGCCCACAGCCTT G-3′。

1.2.5 肝臟ERS標(biāo)志物蛋白表達(dá)測(cè)定：采用Western blot法測(cè)定磷酸化胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（phosphorylated pancreatic ER kinase，p-PERK）、磷酸化山梨醇要求激酶1（phosphorylated inositol-requiring enzyme 1，p-IRE1）和活化轉(zhuǎn)錄因子 6（activating transcription factor-6，ATF-6）蛋白表達(dá)。于肝臟組織勻漿中加入10倍裂解液，13 000 r/min離心15 min，BCA法測(cè)蛋白含量。取20 μg蛋白進(jìn)行10%聚丙烯凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入1∶1 000稀釋的抗體，4℃搖床過(guò)夜，TTBS緩沖液洗膜后加入1∶10 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，室溫孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。用IMAGEJ軟件分析，以目的蛋白的灰度值除以?xún)?nèi)參14-3-3的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。每組隨機(jī)選6例樣本進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。p-PERK抗體（磷酸化位點(diǎn)：Thr980）由 cell signaling 公司提供，p-IRE1（磷酸化位點(diǎn)：Ser724）抗體、總IRE-1抗體由ABCAM公司提供，ATF-6由Santa Cruz公司提供。內(nèi)參抗體GADPH由Kangchen公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)16周后各組大鼠指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠實(shí)驗(yàn)起始體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），飼料喂養(yǎng)16周后高果糖組大鼠體質(zhì)量高于對(duì)照組（P<0.01）；氧化苦參堿組體質(zhì)量較高果糖組大鼠體質(zhì)量明顯減輕（P<0.01），而與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。高果糖組的血葡萄糖、血胰島素及HOMA指數(shù)較對(duì)照組明顯增加（P<0.01），經(jīng)氧化苦參堿干預(yù)后血葡萄糖、血胰島素及HOMA指數(shù)較高果糖組顯著降低（P<0.01）。與對(duì)照組比較，高果糖組的血清ALT、AST、肝質(zhì)量及肝臟TG水平顯著增高（P均<0.01），氧化苦參堿組上述指標(biāo)均顯著低于高果糖組（P均<0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠喂養(yǎng)16周時(shí)的基本指標(biāo)（±s）Tab.1 Basic characteristics in rats after 16-week feeding（±s）

表1 各組大鼠喂養(yǎng)16周時(shí)的基本指標(biāo)（±s）Tab.1 Basic characteristics in rats after 16-week feeding（±s）

1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01 vs control group；3）P<0.05，4）P<0.01 vs high fructose group.

GroupBody mass（g）FBG（mmol/L）FINS（mIU/L）HOMA indexSerum ALT（IU/L）Serum AST（IU/L）Liver weight（g）Liver TG（μmol/g）Control group 434±23 5.4±0.4 11.5±3.4 2.76±0.36 38.2±4.8 82.5±10.1 12.2±0.3 8.6±0.2 High fructose group 489±201） 6.6±0.52） 17.9±2.12） 5.26±0.342） 54.1±3.92） 104.8±8.22） 16.4±0.72） 28.2±2.32）Oxymatrine group 452±183） 5.9±0.64） 12.8±1.84） 3.36±0.414） 48.6±3.54） 94.3±9.84） 13.9±0.32），4） 16.1±1.81），4）

2.2 肝組織油紅O染色結(jié)果

對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列緊密，邊緣清晰，胞質(zhì)未見(jiàn)脂滴；高果糖組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量脂滴；而氧化苦參堿組大鼠肝細(xì)胞脂滴較對(duì)照組明顯減少（圖1）。

2.3 各組小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78、CHOP的基因表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，高果糖組GRP78、CHOPmRNA水平顯著增高（P<0.01），而氧化苦參堿組的GRP78、CHOPmRNA水平較對(duì)照組顯著下降（P<0.01），見(jiàn)表2。

2.4 各組肝臟ERS標(biāo)志物的蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，高果糖組p-PERK、p-IRE-1/t-IRE-1和ATF-6蛋白表達(dá)均明顯增加（P<0.01），而氧化苦參堿組大鼠的上述蛋白表達(dá)水平較高果糖組顯著下降（P<0.01），見(jiàn)圖 2，表 3。

表2 各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78和CHOP的基因表達(dá)（±s）Tab.2 Gene expression of ER chaperonsGRP78andCHOPin rats（±s）

表2 各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78和CHOP的基因表達(dá)（±s）Tab.2 Gene expression of ER chaperonsGRP78andCHOPin rats（±s）

1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01 vs control group；3）P<0.01 vs high fructose group.

Group GRP78/GADPH CHOP/GADPH Control group 1.00±0.16 1.00±0.13 High fructose group 2.01±0.242） 1.83±0.122）Oxymatrine group 1.43±0.121），3） 1.41±0.161），3）

3 討論

NAFLD是一組和代謝綜合征相關(guān)的脂質(zhì)沉積肝病的疾病，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌［6］。近年來(lái)，NAFLD是西方國(guó)家最常見(jiàn)的慢性肝病，在我國(guó)也較常見(jiàn)，尚缺乏特效的治療藥物。本研究通過(guò)16周的慢性高果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)出大鼠肝臟脂質(zhì)沉積和肝細(xì)胞損傷（表現(xiàn)為血 AST、ALT升高），同時(shí)伴有 FBG、FINS、HOMA 指數(shù)增高等胰島素抵抗的表現(xiàn)，表明了果糖過(guò)量攝入對(duì)機(jī)體代謝的危害，與既往的研究一致［7］。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)氧化苦參堿的干預(yù)，高果糖喂養(yǎng)的大鼠肝臟TG顯著減少，肝損傷減輕，并伴有糖代謝指標(biāo)的顯著改善，表明氧化苦參堿是一個(gè)治療NAFLD和改善IR的藥物。

表3 各組大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子標(biāo)志物蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.3 Protein expression in ERS molecular markers in liver in rats（±s）

表3 各組大鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子標(biāo)志物蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.3 Protein expression in ERS molecular markers in liver in rats（±s）

1）P ＜ 0.01，2）P ＜ 0.05 vs control group；3）P<0.01vs high fructose group.

Group p-PERK GADPH p-IRE-1 t-IRE-1 ATF-6 Control group 124.22±18.60 180.03±14.32 198.61±15.62 257.94±20.19 154.82±20.42 High fructose group 286.12±16.121） 182.67±21.09 336.93±29.741） 245.83±13.52 452.44±43.011）Oxymatrine group 133.69±28.293） 173.01±17.44 212.75±23.773） 242.37±24.59 241.02±19.992），3）

近年研究證明ERS與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，通過(guò)對(duì)ERS的抑制可改善ob/ob小鼠的脂肪肝［8］。當(dāng)病毒感染、飲食因素失調(diào)等引起非折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)堆積時(shí)，即出現(xiàn)ERS，同時(shí)伴有非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。UPR 是ERS的保護(hù)機(jī)制，目前尚無(wú)直接反應(yīng)ERS的標(biāo)志物，UPR的通路激活即標(biāo)志了ERS的發(fā)生。UPR有3條途徑，分別為磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始因子α亞單位（p-PERK-eIF2α）通路、肌醇要求酶1-X盒連接蛋白1（IRE-1-XBP-1）通路和ATF-6通路［9］。本研究檢測(cè)了慢性高果糖喂養(yǎng)后大鼠肝內(nèi)3條UPR通路的上游標(biāo)志物p-PERK、IRE-1和ATF-6，經(jīng)過(guò)16周高果糖飲食喂養(yǎng)，大鼠肝內(nèi)3種蛋白表達(dá)均明顯升高，提示反映ERS的UPR的3條途徑均被激活，并伴隨ERS伴侶分子GRP78和CHOP基因表達(dá)的增加，表明高果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)的脂肪肝的發(fā)生發(fā)展與ERS有關(guān)。然而，根據(jù)本研究結(jié)果，尚不能明確脂肪肝發(fā)生與ERS的因果關(guān)系，ERS介導(dǎo)果糖誘導(dǎo)的脂肪肝可能有兩種機(jī)制：一種可能是果糖首先刺激脂質(zhì)合成［10］，繼之出現(xiàn)ERS。ER是脂質(zhì)合成的器官，當(dāng)果糖誘發(fā)肝內(nèi)大量脂質(zhì)合成時(shí)，ER的工作負(fù)荷加重，從而出現(xiàn)ERS；另一個(gè)可能是果糖本身在肝臟的大量存在改變了細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，出現(xiàn)ERS，繼之ERS直接促進(jìn)了脂質(zhì)沉積。

與高果糖組比較，氧化苦參堿組大鼠的UPR上游標(biāo)志物的蛋白表達(dá)和ERS伴侶分子表達(dá)均減少，ERS較高果糖組改善，提示氧化苦參堿減輕高果糖喂養(yǎng)大鼠肝脂質(zhì)沉積和肝損傷與其改善ERS有關(guān)。ERS的改善可能是氧化苦參堿改善大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的始動(dòng)機(jī)制，亦有可能是苦參堿通過(guò)其他機(jī)制改善肝臟脂質(zhì)沉積后，脂質(zhì)沉積減輕后ERS相應(yīng)緩解，具體的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

值得提出的是，本研究中慢性高果糖喂養(yǎng)引起小鼠肝臟CHOP基因表達(dá)增高。CHOP是反應(yīng)細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子，ERS時(shí)CHOP經(jīng)上游轉(zhuǎn)錄元件IREI、PERK和ATF6調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)CHOP基因敲除可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)抗ERS所致凋亡的能力［11］。CHOP對(duì)細(xì)胞增生及分化具有十分重要的作用，是一個(gè)由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換的重要信號(hào)分子。通過(guò)本研究可以看出，經(jīng)過(guò)16周高果糖喂養(yǎng)后，大鼠肝內(nèi)CHOP表達(dá)升高，提示肝組織內(nèi)存在肝細(xì)胞凋亡事件；而氧化苦參堿組CHOP基因表達(dá)降低，提示肝細(xì)胞凋亡減輕。

總之，本試驗(yàn)結(jié)果表明了果糖過(guò)量攝入對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的危害和氧化苦參堿對(duì)NAFLD可能的治療作用，氧化苦參堿治療可改善高果糖喂養(yǎng)大鼠的肝臟脂質(zhì)沉積和胰島素抵抗，其機(jī)制可能與氧化苦參堿改善肝細(xì)胞ERS有關(guān)，具體機(jī)制尚需深入研究。

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