鄒國(guó)良，仲維莉，劉莉，胡健

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，哈爾濱 150040）

再灌注策略能夠挽救急性心肌梗死時(shí)瀕臨壞死的心肌，但再灌注后可引起心肌損傷加重，發(fā)生缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，I/RI）［1］。缺血后處理（ischemic postconditioning，IPostC），即心肌缺血后，在長(zhǎng)時(shí)間的灌注之前，進(jìn)行1次或數(shù)次短暫重復(fù)的心肌缺血再灌注，能提高心肌對(duì)之前發(fā)生的較長(zhǎng)時(shí)間缺血的耐受性［2］，在抗心肌細(xì)胞凋亡、減少心肌梗死面積、保護(hù)內(nèi)皮功能等方面發(fā)揮保護(hù)作用［3～8］。然而，IPostC對(duì)于糖尿病I/RI性心肌是否具有同樣的保護(hù)作用及其發(fā)生機(jī)制仍有待探討。本研究應(yīng)用糖尿病大鼠模型，結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支（left anterior desscending coronary artery，LAD）模擬在體心肌缺血再灌注，通過(guò)觀察心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）的變化，評(píng)價(jià)IPostC對(duì)糖尿病大鼠心肌I/RI的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：健康12周齡雄性SD大鼠48只，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑：氯化三苯基四氮唑、臺(tái)盼藍(lán)（武漢博士德公司），TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物制劑有限公司），CK-MB試劑盒、鏈脲佐菌素（北京博奧森生物制劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備：經(jīng)尾靜脈注射2%鏈脲佐菌素溶液（45 mg/kg），24 h內(nèi)給予不限制飲用10%葡萄糖溶液，72 h后采尾血測(cè)血糖，連續(xù)測(cè)3 d，若血糖持續(xù)≥16.7 mmol/L，則視為造模成功。糖尿病大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理：隨機(jī)將大鼠分為：（1）正常組：正常大鼠自由飼食水，不做任何手術(shù)處理；（2）假手術(shù)（sham）組：糖尿病大鼠開(kāi)胸后在LAD下穿線(xiàn)，不結(jié)扎；（3）缺血再灌注（IR）組：糖尿病大鼠結(jié)扎LAD 造成缺血 30 min，再灌注 2 h；（4）缺血后處理（IPostC）組：糖尿病大鼠結(jié)扎LAD 30 min，再灌注30 s，阻斷 30 s，重復(fù) 3 次，再灌注 2 h。

1.2.3 肌酸激酶同工酶（creatine kinase workers MB，CK-MB）的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)由頸動(dòng)脈采血，室溫靜置 10 min，10 000 r/min 離心 15 min，取上清，-20 ℃凍存。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中的CKMB。

1.2.4 心肌梗死范圍測(cè)定：經(jīng)頸動(dòng)脈采血后，IR組、IPostC組每組隨機(jī)選取6只大鼠，原位結(jié)扎LAD，從右頸動(dòng)脈注入1%臺(tái)盼藍(lán)3 mL/kg，使之灌注藍(lán)染非缺血區(qū)心肌。隨即取下整個(gè)心臟，以PBS沖洗，剪去心房，置-20℃冷凍20 min后，沿心臟長(zhǎng)軸等分為4～5份，切片；置于1%TTC溶液中37℃孵育30 min，缺血的心肌組織被染成磚紅色，梗死心肌呈灰白色。通過(guò)Optimax圖像處理軟件進(jìn)行分析，并計(jì)算梗死面積（infarct size，IS）與缺血區(qū)面積（area at risk，AAR）的比值（IS/AAR）。

1.2.5 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)：應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)AI，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用彩色病理圖文分析系統(tǒng)（OLYPUS BX-6.0顯微照相儀），在光學(xué)顯微鏡下，對(duì)TUNEL染色切片行顯微攝像及檢測(cè)。取陽(yáng)性染色區(qū)域不同的5個(gè)視野，由強(qiáng)至弱取圖5幅，檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，以心肌凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總心肌細(xì)胞數(shù)的百分比作為心肌AI。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中CK-MB水平的比較

比較缺血前各組大鼠血清CK-MB，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；再灌注2 h后，IR組血清CK-MB明顯升高，與正常組、sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），IPostC組血清CK-MB水平明顯低于IR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組大鼠血清中C K-M B水平的比較（±s，n=1 2）T a b.1 C o m p a r i s o n o f s e r u m C K-M B l e v e l i n e a c h g r o u p（±s，n=1 2）

表1 各組大鼠血清中C K-M B水平的比較（±s，n=1 2）T a b.1 C o m p a r i s o n o f s e r u m C K-M B l e v e l i n e a c h g r o u p（±s，n=1 2）

1）P<0.0 1 v s n o r m a l g r o u p；2）P<0.0 1 v s I R g r o u p.

?

2.2 各組大鼠心肌梗死面積的比較

非缺血心肌被染成藍(lán)色，缺血心肌被染成磚紅色，梗死心肌呈灰白色。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算IS/AAR，結(jié)果顯示：IR組可見(jiàn)明顯的梗死心肌，IS/AAR為29.6%±4.3%，與IPostC組（16.9%±2.6%）比較，心肌梗死面積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞AI的比較

TUNEL染色結(jié)果（圖3）顯示：凋亡細(xì)胞胞核被染成棕黃色，正常組、sham組僅可見(jiàn)少量的凋亡細(xì)胞，IR組凋亡細(xì)胞明顯增多，計(jì)算AI結(jié)果顯示：IR組AI（25.1%±4.0%）高于正常組（3.6%±0.6%）和sham組（3.8%±0.4%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。IPostC 組 AI（15.9%±2.9%）明顯低于 IR 組（25.1%±4.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

IPostC可減輕心肌I/RI，但其作用機(jī)制目前尚不完全清楚。研究證實(shí)，在心肌I/RI中，梗死和凋亡是細(xì)胞數(shù)量減少的原因，它們共同參與了I/RI中心肌細(xì)胞的死亡過(guò)程。本研究采用梗死面積和AI作為檢測(cè)糖尿病大鼠心肌I/RI的指標(biāo)。采用TTC染色法檢測(cè)了大鼠心肌梗死面積，非缺血心肌被染成藍(lán)色，缺血心肌被染成磚紅色，梗死心肌呈灰白色。結(jié)果顯示：IPostC能減小大鼠心肌梗死面積，降低IS/AAR比值。CK-MB是心肌受損的重要指標(biāo)，當(dāng)心肌受損時(shí)CK-MB從心肌細(xì)胞釋放入血中。本研究結(jié)果顯示：IPostC在減小大鼠心肌梗死范圍的同時(shí)，能夠降低大鼠血清中CK-MB水平，提示IPostC能夠減輕糖尿病大鼠心肌I/RI的程度。

細(xì)胞凋亡是指在一定的生理或病理?xiàng)l件下遵循自身的程序，由基因調(diào)控的主動(dòng)的死亡過(guò)程。它是擴(kuò)大心肌梗死范圍的一個(gè)獨(dú)立因子，不僅可影響心肌梗死的面積，而且能夠促使心臟重構(gòu)［9］。心肌凋亡細(xì)胞主要位于心肌梗死區(qū)周?chē)?。心肌?xì)胞被多種病理性因素（如血管堵塞、缺氧及生物毒性等）刺激后，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)誘發(fā)凋亡程序啟動(dòng)。細(xì)胞凋亡是I/RI的特征性改變，細(xì)胞凋亡的發(fā)現(xiàn)對(duì)I/RI預(yù)后的判斷具有重要意義。提示我們可以從細(xì)胞凋亡角度對(duì)缺血再灌注后心功能的恢復(fù)及心肌保護(hù)進(jìn)行研究［9，10］。本研究采用TUNEL法進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)，凋亡細(xì)胞胞核被染成棕黃色。結(jié)果顯示：IPostC可明顯抑制I/RI引起的心肌細(xì)胞凋亡，降低I/RI的程度，從而起到保護(hù)心肌的作用。

本課題組已證實(shí)IPostC可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白的活化，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用，但PI3K/AKT信號(hào)通路激活下游后如何發(fā)揮心肌保護(hù)作用還有待進(jìn)一步研究［11］。

［1］Zhao JL，Yang YJ，You SJ，et a1.Different effects of postconditioning on myocardial no-reflow in the normal and hypercholesterolemic mini-swines［J］.Microvasc Res，2007，73（2）：137-142.

［2］Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparison with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physio1，2003，285（2）：H579-H588.

［3］Yang XM，Philipp S，Downey JM，et al.Postconditioning′s protection is not dependent on circulation blood factors or cells but involves adenosine receptors and requires PI3-kinase and guanylate cyclase activation［J］.Basic Res Cardiol，2005，100（1）：57-63.

［4］Song WY，Dong HL，Cheng Q，et al.Ischemic postconditioning induces neuroprotectionvia up-regulationof endogenous antioxidant en－zyme activities：experiment with rabbits ［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88（33）：2355-2359.

［5］Zhang YM，Wang Y，Liu XH，et al.Cardioprotective effect of edaravone pharmacological postconditioning on acute myocardial ischemia/reperfusion injury：experiment with rat［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88（36）：2558-2561.

［6］Wang KX，Hu SY，Jiang XS，et al.Protective effects of ischaemic postconditioning on warm/cold ischaemic reperfusion injury in rat liver：a comparative study with ischaemic preconditioning［J］.Chin Med J，2008，121（20）：2004-2009.

［7］孫凱，劉志蘇，孫權(quán).缺血后處理對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（12）：2480-2484.

［8］朱偉偉，王鵬程，李小松.IL-17在缺血再灌注損傷中作用的研究進(jìn)展［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（2）：304-307.

［9］Gross ER，Gross GJ.Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning［J］.Cardiovasc Res，2006，70（2）：212-221.

［10］PaillardM，GomezL，Augeul L，et al.Postconditioning inhibits mPTP opening independent of oxidative phosphorylation and membrane potential［J］.J Mol Cell Cardiol，2009，46（6）：902-909.

［11］鄒國(guó)良，仲維莉，胡健.缺血后處理對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38（10）：745-748.