李澤良，孫丹，楊宇翀，許曉龍，孔垂?jié)?/p>

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110001）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性惡性腫瘤致死的第二大疾病，目前對該病的最佳治療方案和最有效的治療藥物尚未達成共識［1，2］。抑制雄性激素的生物合成及在其同源受體的活性在PCa的治療中具有決定性意義。前列腺內(nèi)部分有活性的雄性激素來源于由腎上腺分泌的活性甾體激素的前體脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）和雄烯二酮（androstenedione，ADT）［3，4］。17β 羥基類固醇脫氫酶Ⅲ（17βhydroxysteroiddehydrogenaseⅢ，17βHSD3）是介導(dǎo)最后一步由無活性前體向有活性激素轉(zhuǎn)化的酶，是 17βHSD 家族成員之一［5～7］，該家族對 PCa、乳腺癌等激素依賴性疾病有直接作用。因此，針對17βHSD3的小分子靶向抑制劑的研究已成為PCa研究的新熱點。研究發(fā)現(xiàn)，18β甘草次酸（18β-glycyrrhetinic acid，18β-GA） 對 17βHSD3 具有抑制作用，但其作用機制尚不明確［8］。本研究擬尋找18βGA作用于PCa細胞的信號傳導(dǎo)通路，明確其抑制17βHSD3的表達及PCa細胞生長的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性激素依靠性PCa細胞株LNCaP購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；17βHSD3-pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達HEK293細胞系受贈于美國新澤西州普林斯頓藥物研究機構(gòu)的Matthew V.Lorenzi教授。18β-GA 購自 Sigma-Aldrich公司；MTT購自Applygen Technologies公司；抗P-eIF2α及抗活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）抗體均購自 Santa Cruz Biotechnology公司；用于17βHSD3mRNA Real-time qPCR檢測及CypA的引物均由Sigma-Aldrich公司設(shè)計并合成；eIF2α對應(yīng)的siRNA及scramble RNA、脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine LTX購自Invitrogen公司；SYBR Green 試劑盒購自 Toyobo 公司；Trizol、cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：LNCaP細胞及17βHSD3-pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)于含10%FBS及1%青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。17βHSD3-pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系培養(yǎng)時另加入500 ng/mL的G418，以篩除非目標(biāo)細胞。

1.2.2 MTT檢測：將LNCaP細胞加入至96孔板中（5 000/孔），37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng) 4 h。細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，將含有不同濃度18β-GA（終濃度：0，4，8，12，16 μmol/L） 的培養(yǎng)基 100 μL 加入孔內(nèi)。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，再次更換培養(yǎng)基（100 μL/孔），加入MTT溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm處各孔的吸光值。每組設(shè)4個復(fù)孔，重復(fù)3次。各組吸光值用±s表示。

1.2.3 Western blot：提取各組細胞全蛋白，取 20 μg蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜PVDF。用含1%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，一抗溶液（用0.1%BSA稀釋2 000倍）室溫下振蕩孵育1 h，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液（用PBST稀釋10 000倍），室溫下振蕩孵育1 h。堿性磷酸酶法顯色。β-actin作內(nèi)參照。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 RNA的提取及Real-time qPCR：細胞以1×105/孔傳代于12孔板中培養(yǎng)4 h，細胞貼壁后，更換含 18β-GA（終濃度 8 μmol/L）的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h后回收。對照組以等體積的DMSO作為通用對照。PBS洗3次，用Trizol及氯仿抽提細胞內(nèi)總RNA；紫外分光光度計測量濃度，每個樣本使用1 μg的RNA進入下一步實驗；用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；使用SYBR Green試劑盒進行Real-time qPCR反應(yīng)，PCR的反應(yīng)條件為：95℃10 min，反應(yīng) 40 個下述循環(huán)：95 ℃ 20 s，54 ℃ 30 s，72℃30 s。CypA作內(nèi)參照。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染：LNCaP細胞傳代于12孔板中（1×105/孔），4 h細胞貼壁后，更換不含抗生素的培養(yǎng)基。以800 ng質(zhì)粒稀釋于200 μL OPTI-MEM中，加入質(zhì)脂體類轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX 4 μL，靜置30 min，緩慢加入培養(yǎng)基中，4 h后，更換不含抗生素的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 18β-GA可顯著抑制LNCaP細胞的增殖

MTT法檢測結(jié)果如圖1所示：終濃度8，12，16 μmol/L的18β-GA作用48 h時，均能顯著抑制LNCaP細胞的增殖（P<0.05）；而濃度為4 μmol/L時，對細胞增殖的抑制作用不明顯。故選擇終濃度8 μmol/L的18β-GA進行后續(xù)實驗。另外，如圖2所示：終濃度8 μmol/L的18β-GA作用24 h時對細胞增殖的抑制作用不明顯，但在48 h及72 h時，則能夠顯著抑制LNCaP細胞增殖（P<0.05）。因此，18β-GA對LNCaP細胞增殖的抑制作用具有劑量和時間依賴性。

2.2 18β-GA對LNCaP細胞中17βHSD3mRNA表達的抑制

Real-time qPCR結(jié)果如圖3所示：8 μmol/L的18β-GA作用LNCaP細胞48 h后，細胞內(nèi)17βHSD3 mRNA的表達水平較DMSO對照組顯著降低（P<0.05）。

2.3 18β-GA對 17βHSD3-pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達HEK293細胞系中17βHSD3mRNA表達的抑制

Real-time qPCR檢測結(jié)果如圖4顯示：8 μmol/L 18β-GA作用17βHSD3-pcDNA3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達HEK293細胞48 h后，細胞內(nèi)17βHSD3mRNA的表達水平顯著降低（P<0.05）。

2.4 18β-GA通過使eIF2α磷酸化抑制17βHSD3 mRNA的轉(zhuǎn)錄

Western blot結(jié)果如圖5所示：18β-GA的作用下，p-eIF2α的表達于24 h開始出現(xiàn)增強，48 h達到最大值。

2.5 18β-GA選擇性增加ATF4的表達

Western blot結(jié)果如圖 6所示：18β-GA激活eIF2α磷酸化后，降低了細胞內(nèi)整體RNA轉(zhuǎn)錄開始的頻率，但卻選擇性的增加了ATF4mRNA的轉(zhuǎn)錄，進而通過ATF4的靶向基因誘導(dǎo)細胞凋亡。

2.6 siRNA敲除eIF2α基因可明顯減弱18β-GA對17βHSD3mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用

我們首先確認(rèn)了siRNA的基因干擾效率，結(jié)果如圖7所示：當(dāng)通過瞬時轉(zhuǎn)染siRNA敲除eIF2α基因后，即使在18β-GA作用下，p-eIF2α蛋白的表達亦明顯減少。隨后我們檢測了18β-GA對17βHSD3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的抑制效果，結(jié)果如圖8所示：sieIF2α組18β-GA抑制17βHSD3mRNA的效果明顯減弱（P<0.05）。

3 討論

PCa是一種雄性激素相關(guān)性疾病。目前針對PCa激素水平的調(diào)控主要是通過抑制雄性激素的生物合成及其在同源受體的活性達到治療目的［9，10］。但有研究表明，應(yīng)用不同的內(nèi)分泌治療藥物抑制其同源受體活性的方法不可避免的引起了骨質(zhì)疏松、抑郁癥等嚴(yán)重的不良反應(yīng)［11］。因此，抑制雄性激素的生物合成在PCa治療中相對更為安全有效。

外周組織中，有活性的雄性激素可以通過外周血中含量很高的無活性的激素前體的轉(zhuǎn)化在靶器官中直接合成，17βHSDs家族是催化這一系列生化反應(yīng)的關(guān)鍵酶。近年來針對17βHSD3的小分子靶向抑制劑的篩選成為研究熱點，而其作用機制尚不明確。本研究探討了17βHSD3的小分子靶向抑制劑18β-GA對PCa細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）通路的作用機制。結(jié)果顯示，18β-GA能顯著抑制PCa細胞的增殖，并誘導(dǎo)了PCa細胞的凋亡。同時，18β-GA還介導(dǎo)了eIF2α磷酸化水平的增加，降低了包括17βHSD3mRNA在內(nèi)的細胞整體轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)eIF2α被siRNA干擾后，18β-GA對17βHSD3mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用也明顯減弱。提示18β-GA對17βHSD3mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制至少部分是通過eIF2α磷酸化這條通路介導(dǎo)的。磷酸化的eIF2α可以選擇性增加包括ATF4在內(nèi)的個別轉(zhuǎn)錄因子的表達［12］，而ATF4可與CHOP的啟動子上的AARE1順式作用元件結(jié)合，從而誘導(dǎo)細胞凋亡［13］。因此，我們推測18β-GA誘導(dǎo)eIF2α磷酸化后，選擇性地增加了ATF4的表達，并通過CHOP介導(dǎo)了PCa細胞的凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18β-GA主要是通過ER stress通路同時實現(xiàn)了對癌細胞生長的抑制及對17βHSD3蛋白表達的調(diào)控。

本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)eIF2α被siRNA干擾后，并未完全阻斷18β-GA對17βHSD3mRNA的作用，所以我們推測18β-GA可能還存在其他的路徑誘導(dǎo)細胞凋亡及調(diào)控酶水平的表達。今后，我們會繼續(xù)探討18β-GA可能作用的信號通路，同時尋找更多的17βHSD3靶向小分子抑制劑。

［1］Harada K，Kubo H，Abe J，et al.Discovery of potent and orally bioavailable 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 3 inhibitors［J］.Bioorg Med Chem，2012，20（10）：3242-3254.

［2］畢泗成，徐秀紅，邵強，等.米非司酮對雄激素非依賴性前列腺癌LNCaPC4-2和PC3細胞的作用機制［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，25（2）：250-252.

［3］EbelingP，KoivistoVA.Physiologicalimportanceofdehydroepiandrosterone［J］.Lancet，1994，343（8911）：1479-1481.

［4］Adams JB.Control of secretion and the function of C19-delta 5-steroids of the human adrenal gland［J］.Mol Cell Endocrinol，1985，41（1）：1-17.

［5］Mindnich R，Moller G，Adamski J.The role of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenases［J］.Mol Cell Endocrinol，2004，218（1-2）：7-20.

［6］Adamski J，Jakob FJ.A guide to 17beta-hydroxysteroid dehydrogenases［J］.Mol Cell Endocrinol，2001，171（1-2）：1-4.

［7］Mindnich R，Hrabe de Angelis M，Adamski J.Functional genome analysis indicates loss of 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 enzyme in the zebrafish［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2007，103（1）：35-43.

［8］Spires TE，F(xiàn)ink BE，Kick EK，et al.Identification of novel functional inhibitors of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase typeⅢ（17beta-HSD3）［J］.Prostate，2005，65（2）：159-170.

［9］Scher HI，Buchanan G，Gerald W，et al.Targeting the androgen receptor：improving outcomes for castration-resistant prostate cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2004，11（3）：459-476.

［10］Roach M.Hormonal therapy and radiotherapy for localized prostate cancer：who，where and how long?［J］.J Urol，2003，170 （6 Pt 2）：S35-S40.

［11］Kruchten P，Werth R，Bey E，et al.Selective inhibition of 17betahydroxysteroid dehydrogenase type 1（17betaHSD1）reduces estrogen responsive cell growth of T47-D breast cancer cells［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2009，114（3-5）：200-206.

［12］Liu XA，Song J，Jiang Q，et al.Expression of the hyperphosphorylated tau attenuates ER stress-induced apoptosis with upregulation of unfolded protein response［J］.Apoptosis，2012，17（10）：1039-1049.

［13］Zong ZH，Du ZX，Li N，et al.Implication of Nrf2 and ATF4 in differential induction of CHOP by proteasome inhibition in thyroid cancer cells［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1823（8）：1395-1404.