喻備，王亞榮，殷祥瑞，唐偉

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，重慶 400016）

膀胱癌是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。手術(shù)、化療及放療后患者復(fù)發(fā)率高，生存率不理想。腫瘤的基因治療是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，單純皰疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK）/丙氧鳥苷（ganciclovir，GCV）是目前研究最早最徹底的，廣泛用于腫瘤基因治療的自殺基因系統(tǒng)，而尋找腫瘤特異的靶向基因治療載體是腫瘤基因治療成功的關(guān)鍵技術(shù)，也是腫瘤基因治療的難點(diǎn)。國內(nèi)外研究已證實(shí)［1～3］，雙歧桿菌對(duì)腫瘤組織的厭氧壞死區(qū)有特異的靶向性，同時(shí)對(duì)人體具有較高的安全性，是一種良好的腫瘤基因治療靶向載體。作者前期研究曾利用嬰兒雙歧桿菌（bifidobacterium infantis，BI）介導(dǎo)pGEX-TK/GCV治療大鼠膀胱癌，發(fā)現(xiàn)其療效顯著，膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加［4］，但是其機(jī)制仍不十分清楚。研究證實(shí)［5］，F(xiàn)as/FasL信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色。本實(shí)驗(yàn)在驗(yàn)證雙歧桿菌介導(dǎo)pGEX-TK/GCV治療大鼠膀胱癌療效的同時(shí)，探討Fas/FasL介導(dǎo)的死亡受體信號(hào)通路是否參與了雙歧桿菌介導(dǎo)pGEX-TK/GCV治療系統(tǒng)誘導(dǎo)大鼠膀胱癌細(xì)胞凋亡的過程，旨在進(jìn)一步明確其抑癌作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：嬰兒雙歧桿菌-pGEX-TK菌種、嬰兒雙歧桿菌-pGEX-5X-1菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存，N－甲基亞硝基脲（N-Nitroso-N-methylurea，MNU）購自美國Sigma公司，TUNEL試劑盒購于瑞士Roche公司，RT-PCR試劑盒（DRR037S）、DNAMakerDL2000購于TaKaRa公司，兔抗大鼠Fas、FasL多克隆抗體購自Santa Cruz公司（北京中杉生物技術(shù)公司分裝），兔抗大鼠GAPDH購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，山羊抗兔二抗、多聚甲醛、PVDF膜購于北京鼎國生物試劑公司，GCV購于宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司（批號(hào)1011001）。PMSF、BCA法蛋白定量試劑盒、SDS-Page凝膠電泳試劑盒和ECL顯影劑均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 動(dòng)物：選用健康成年雌性SD大鼠70只，8～10周齡，體質(zhì)量180～200 g，飼養(yǎng)環(huán)境為重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無特定病原體（specific pathogen free，SPF）動(dòng)物房。動(dòng)物房溫度為（25±2）℃，濕度為（60±5）%，12 h晝夜節(jié)律。大鼠可以自由飲水和進(jìn)食。

1.1.3 儀器：光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡BX51（日本Olympus），低溫高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀公司），PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司），紫外分光儀（GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠膀胱癌模型的建立及分組：采用MNU膀胱灌注法［6］建立SD大鼠膀胱癌模型，選取荷瘤大鼠54只。將54只荷瘤大鼠隨機(jī)分成3組，每組18只，分別為：生理鹽水對(duì)照組（生理鹽水組）、BI-pGEX-5X-1組（空質(zhì)粒組）、BI-pGEX-TK組（重組質(zhì)粒組）。分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水、BI-pGEX-5X-1菌液、BI-pGEX-TK菌液0.5 mL（含重組嬰兒雙歧桿菌約4.4×109個(gè)），間隔7 d重復(fù)注射1次，共4次。從處理第1天開始，各組大鼠連續(xù)28 d腹腔注射GCV（50 mg/kg）。于治療結(jié)束后第1天采用斷頸法處死大鼠，解剖膀胱腫瘤，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。

1.2.2 各組荷瘤大鼠膀胱質(zhì)量測(cè)定：于治療結(jié)束后采用斷頸法處死大鼠，沿大鼠腹壁中線逐層進(jìn)入腹腔，仔細(xì)分離膀胱，去除膀胱周圍脂肪組織，緊貼膀胱壁離斷輸尿管，向下解剖暴露膀胱頸部至前列腺，于前列腺上緣離斷膀胱?？v行解剖膀胱，觀察膀胱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況，然后用濾紙吸干液體，稱取各組荷瘤大鼠膀胱的質(zhì)量。

1.2.3 TUNEL法原位檢測(cè)膀胱腫瘤細(xì)胞的凋亡及半定量分析：實(shí)驗(yàn)步驟按TUNEL試劑盒說明書操作。在熒光顯微鏡下觀察拍照后，加HRP標(biāo)記的抗熒光素抗體，DAB顯色，普通光學(xué)顯微鏡觀察。細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)凝集成塊、呈棕褐色染色者為凋亡細(xì)胞。每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，凋亡指數(shù)計(jì)算（apoptotic index，AI），AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

1.2.4 半定量RT-PCR檢測(cè)Fas、FasLmRNA水平：取50 mg大鼠膀胱腫瘤組織用眼科剪剪碎，放入滅酶的勻漿器中，加入1 mL TRIzol提取各組膀胱腫瘤總RNA，紫外分光光度計(jì)定量，各取2 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用1 μL cDNA為模板分例進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)大鼠Fas/FasLcDNA序列由上海生工設(shè)計(jì)并合成RT-PCR引物，見表1。PCR擴(kuò)增體系體積為25 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 min，變性 95 ℃ 30 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。每例取5 μL RT-PCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以GAPDH作為內(nèi)參照，凝膠成像系統(tǒng)攝像并用Quantity One軟件測(cè)定各條帶與GAPDH的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，其比值為各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測(cè)大鼠膀胱腫瘤Fas/FasL蛋白表達(dá)：將100 mg大鼠膀胱腫瘤用眼科剪剪碎為小塊，放入勻漿器中，加入990 μL RIPA及10 μL 10 mg/mL PMSF溶液，用力研磨成均勻一致的懸液，收集懸液，12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上清液至1.5 mL EP管中，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。于總蛋白中加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后在沸水中處理10 min，取總蛋白40 μg上樣，8%SDS-PAGE電泳，切膠，半干電轉(zhuǎn)膜儀電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1.5 h，然后分別加入兔抗大鼠GAPDH、Fas、FasL一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，10 min/次。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，TBST漂洗3次，10 min/次。ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)攝像并測(cè)定各目的條帶與GAPDH條帶的灰度值，目的條帶/GAPDH條帶比值為各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠膀胱癌建模及病理結(jié)果

大鼠膀胱癌建模過程中死亡11只，其中2只在膀胱灌注第8周死亡，解剖發(fā)現(xiàn)膀胱內(nèi)有新生物，病理證實(shí)為膀胱移行細(xì)胞癌。選取的54只荷瘤大鼠在治療過程中無死亡，其中有8只出現(xiàn)肉眼血尿，2只出現(xiàn)明顯膿尿。

生理鹽水組及空質(zhì)粒組肉眼觀察及HE染色結(jié)果可見大鼠膀胱壁增厚，其表面可見米粒樣、菜花樣新生物，基底寬，有的表面有潰瘍伴出血性壞死。細(xì)胞異形性明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞大小不一，排列紊亂，極性消失；核畸形，核染色質(zhì)呈粗顆粒狀，常堆積于核膜下；核膜增厚，核仁肥大，核質(zhì)比例大，核分裂像明顯，部分表現(xiàn)為癌細(xì)胞高度未分化，移行上皮結(jié)構(gòu)特征消失，呈彌漫分布或排列成實(shí)體性癌，多乳頭粗短融合，伴局灶性黏膜下、肌層浸潤(rùn)（圖1A、1B）。重組質(zhì)粒嬰兒雙歧桿菌組：相對(duì)于生理鹽水組，腫瘤體積變小，部分出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞壞死，腫瘤細(xì)胞形態(tài)變化不大，間質(zhì)有炎細(xì)胞侵潤(rùn)（圖1C）。各組其他臟器均未見異常。

2.2 各組荷瘤大鼠膀胱質(zhì)量比較

與生理鹽水組及空質(zhì)粒組比較，重組質(zhì)粒組荷瘤大鼠膀胱質(zhì)量明顯降低（P<0.05）。空質(zhì)粒組與生理鹽水組比較，荷瘤大鼠膀胱癌的質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。表明雙歧桿菌介導(dǎo)HSV-TK/GCV能明顯抑制荷瘤大鼠膀胱癌生長(zhǎng)。見表2。

表2 各組荷瘤大鼠膀胱質(zhì)量及AI值（±s）Tab.2 The bladder weights and apoptotic index in rat bladder tumor model（±s）

表2 各組荷瘤大鼠膀胱質(zhì)量及AI值（±s）Tab.2 The bladder weights and apoptotic index in rat bladder tumor model（±s）

1）P<0.05，2）P<0.01 vs normal saline group；3）P<0.05，4）P<0.01 vs empty plasmid group.

GroupnBladder weight（mg）AI（%）Normal saline 18 320.17±17.39 8.4±3.15 Empty plasmid 18 310.78±12.31 10.36±3.51 Recombinant plasmid 18 265.22±14.431），3） 27.18±8.652），4）

2.3 大鼠膀胱腫瘤組織中凋亡細(xì)胞分布及變化

TUNEL法原位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組荷瘤大鼠膀胱腫瘤組織均出現(xiàn)不同程度的凋亡細(xì)胞（圖2），以重組質(zhì)粒組最多。與生理鹽水組及空質(zhì)粒組比較，重組質(zhì)粒組AI值顯著增高（P<0.01）；空質(zhì)粒組與生理鹽水組AI值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見表2。

2.4 大鼠膀胱腫瘤組織Fas/FasLmRNA表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，與空質(zhì)粒組及生理鹽水組比較，重組質(zhì)粒組Fas/FasLmRNA水平顯著增高（P<0.05），空質(zhì)粒組與生理鹽水組比較，F(xiàn)as/FasLmRNA水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見圖3。

2.5 大鼠膀胱腫瘤組織Fas/FasL蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒組Fas/FasL蛋白表達(dá)水平明顯高于空質(zhì)粒組及生理鹽水組（P<0.01），空質(zhì)粒組和生理鹽水組比較，F(xiàn)as/FasL蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見圖4。

3 討論

HSV-TK/GCV是目前廣泛用于腫瘤基因治療研究的自殺基因系統(tǒng)之一，其產(chǎn)生自殺作用的確切效果已被許多研究所證實(shí)［7］，并已經(jīng)開始進(jìn)行臨床試驗(yàn)［8］。尋找一種安全、高效、特異的靶向性載體成為其推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。Li等［9］研究證實(shí)嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)可溶性VEGF受體能抑制小鼠肺癌生長(zhǎng)，Yazawa等［10］研究證實(shí)人工誘導(dǎo)乳腺瘤的大鼠經(jīng)尾靜脈注射人源雙歧桿菌后能特異性地在瘤內(nèi)增殖，并引起腫瘤組織萎縮，延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存期。這些研究均表明，雙歧桿菌作為載體治療實(shí)體腫瘤是可行的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒組處理荷瘤大鼠膀胱癌，大鼠膀胱質(zhì)量顯著降低，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠心、肝、腎和腦組織切片觀察，未發(fā)現(xiàn)明顯異常。結(jié)果表明，雙歧桿菌介導(dǎo)pGEX-TK/GCV治療系統(tǒng)治療荷瘤大鼠膀胱癌是安全、有效的。

HSV-TK/GCV治療腫瘤的機(jī)制也已經(jīng)有了比較廣泛和深入的研究。目前認(rèn)為，其主要機(jī)制為：一是自殺效應(yīng)，另一個(gè)是旁觀者效應(yīng)，它們可能部分通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生效應(yīng)［11～13］。葉剛等［14］利用逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶HSV-TK基因膀胱灌注治療大鼠膀胱腫瘤，發(fā)現(xiàn)大鼠膀胱癌體積有所縮小，腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡。作者利用雙歧桿菌作為載體，成功構(gòu)建了嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)pGEX-TK/GCV治療系統(tǒng)，并初步證實(shí)了其治療荷瘤大鼠膀胱癌的療效，同時(shí)發(fā)現(xiàn)嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)pGEX-TK/GCV處理后，大鼠膀胱癌組織細(xì)胞凋亡明顯增加，caspase 3表達(dá)也顯著增高［4］。本實(shí)驗(yàn)中，重組質(zhì)粒組荷瘤大鼠膀胱癌組織細(xì)胞凋亡顯著增加，而空質(zhì)粒組與生理鹽水組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)pGEX-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌，其主要機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)膀胱癌組織細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

細(xì)胞凋亡是由死亡信號(hào)誘發(fā)的受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡過程，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的一種有效途徑。細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路主要有兩條：一是細(xì)胞外信號(hào)激活胞內(nèi)凋亡酶而誘發(fā)凋亡，即死亡受體信號(hào)通路；另一條是通過細(xì)胞內(nèi)線粒體釋放凋亡酶激活因子激活凋亡酶而發(fā)生凋亡。研究證實(shí)［5，15］，F(xiàn)as/FasL是死亡受體信號(hào)通路誘導(dǎo)凋亡的一個(gè)重要途徑。Fas是一種屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員的膜蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中起著重要的作用，與其配體FasL結(jié)合后，激活下游效應(yīng)蛋白caspase 3誘導(dǎo)表達(dá)Fas蛋白的細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究證實(shí)［16，17］，膀胱腫瘤細(xì)胞的凋亡與Fas/FasL死亡受體信號(hào)通路密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，重組質(zhì)粒組大鼠膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加，F(xiàn)as/FasLmRNA及蛋白表達(dá)均顯著增高，說明Fas/FasL死亡受體信號(hào)通路可能參與了嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)pGEX-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌所誘導(dǎo)的凋亡。此外，除了本實(shí)驗(yàn)所證實(shí)Fas/FasL死亡受體信號(hào)通路表達(dá)變化對(duì)嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)pGEX-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌誘導(dǎo)凋亡有影響外，其他誘導(dǎo)凋亡的途徑（如胞內(nèi)線粒體控制的凋亡途徑）在嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)pGEX-TK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌誘導(dǎo)凋亡所起的作用還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合前期所證實(shí)caspase 3蛋白表達(dá)上調(diào)［4］提示，激活Fas/FasL死亡受體信號(hào)通路，引起下游caspase 3蛋白表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡可能是嬰兒雙歧桿菌介導(dǎo)pGEXTK/GCV治療荷瘤大鼠膀胱癌發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制之一。

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