鮑蕾蕾，陳海飛，卞俊，袁兵(解放軍第411醫(yī)院藥學(xué)科，上海 200434)

健步關(guān)節(jié)膠囊對家兔骨關(guān)節(jié)病模型相關(guān)因子的影響

鮑蕾蕾，陳海飛，卞俊，袁兵(解放軍第411醫(yī)院藥學(xué)科，上海 200434)

目的初步觀察健步關(guān)節(jié)膠囊對實(shí)驗(yàn)性兔膝骨關(guān)節(jié)病的治療作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法將30只健康的新西蘭大白兔分成5組，每組6只，分別為模型組(蒸餾水)、陽性藥組(硫酸氨基葡萄糖膠囊)、健步關(guān)節(jié)膠囊低、中、高劑量組。家兔膝關(guān)節(jié)注射木瓜蛋白酶建立膝關(guān)節(jié)病模型。造模第2天開始給藥，6周后心臟取血，測定血清中NO和SOD的含量。同時(shí)處死動(dòng)物，取膝關(guān)節(jié)滑膜制成病理切片，觀察藥物對關(guān)節(jié)滑膜的影響。結(jié)果健步關(guān)節(jié)膠囊各劑量組能不同程度的提高兔膝關(guān)節(jié)病血清中的SOD活性，中、高劑量組和陽性藥組SOD活性與模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05);健步關(guān)節(jié)膠囊低、中、高劑量組血清NO水平較模型組有不同程度的提高，其中中劑量組和陽性藥組有極顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)論健步關(guān)節(jié)膠囊能顯著提高實(shí)驗(yàn)性膝關(guān)節(jié)病模型家兔血清中SOD的活性和NO的含量，并能顯著改善模型家兔膝關(guān)節(jié)的病理性改變。

健步關(guān)節(jié)膠囊;骨關(guān)節(jié)病;一氧化氮;超氧化物歧化酶

骨關(guān)節(jié)病(osteoarthrosis，OA)是骨科常見病，多發(fā)于中年以后的慢性、進(jìn)行性疾病。臨床表現(xiàn)有受累關(guān)節(jié)疼痛，活動(dòng)加重，休息后緩解，久不活動(dòng)有僵硬感以及骨肥大和晚期功能受限?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)有幾種因素和本病的發(fā)生密切相關(guān)，包括年齡、關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的變化、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的變化、滑液中化學(xué)遞質(zhì)變化、損傷和未知的免疫反應(yīng)。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明此病的發(fā)展同細(xì)胞因子、生長因子、免疫因素有關(guān)，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、透明質(zhì)酸(HA)、白介素-6、白介素-1、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-1)。本實(shí)驗(yàn)通過兔膝骨關(guān)節(jié)病模型觀察健步關(guān)節(jié)膠囊對兔膝骨關(guān)節(jié)病血清NO含量、SOD活性的影響。

1 材料和儀器

1.1 動(dòng)物4～10月齡的健康新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體重1.6～2.0 kg，各組大白兔實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。許可證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.2 藥物健步關(guān)節(jié)膠囊(0.3克/粒，解放軍第411醫(yī)院，批號100122)，由淫羊藿、生地等10味中藥組方。陽性藥硫酸氨基葡萄糖膠囊(0.3 g/粒，重慶太極集團(tuán)，批號100202)。

1.3 試劑木瓜蛋白酶(sigma，由貝基分裝);一氧化氮(NO)試劑盒(批號20080418)、超氧化物歧化酶(SOD)(批號20080418)均由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 儀器DK-8AD型電熱恒溫水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);TJL-16C離心機(jī)(上海安寧科學(xué)儀器廠制造);半自動(dòng)生化測定儀screen master 3000 (HOSPITEX公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)各組兔均在溫度(20±5)℃，濕度(40±10)%條件下自由飲水、攝食。

2.2 動(dòng)物分組及給藥按組間均衡一致的原則，將30只大白兔隨機(jī)分為模型組、陽性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組6只。臨床成人日用量為2.7 g，按體表面積折算成家兔的劑量約為0.15 g/ kg。將臨床治療量作為本實(shí)驗(yàn)的低劑量，即健步關(guān)節(jié)膠囊低劑量組為0.15 g/kg。中劑量和高劑量設(shè)為低劑量的3倍及6倍，即中劑量組為0.45 g/kg，高劑量組為0.90 g/kg。術(shù)后第2天開始ig給藥，每天1次，連續(xù)給藥6周。

2.3 動(dòng)物造模參考文獻(xiàn)，并加以改進(jìn)［1］:兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶，造成骨關(guān)節(jié)病變模型方法。將兔彎曲膝關(guān)節(jié)，經(jīng)關(guān)節(jié)正中或兩側(cè)進(jìn)針將1.6%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.5 ml通過骸上韌帶注入兔膝關(guān)節(jié)腔，分別于實(shí)驗(yàn)的第1、4天注入兔膝關(guān)節(jié)中。

2.4 檢測指標(biāo)6周后心臟取血，測定血清中NO和SOD的含量，同時(shí)處死動(dòng)物，取膝關(guān)節(jié)滑膜制成病理切片。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用ˉx± s表示，采用單因素方差分析，組間差異采用LSD-t法進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 健步關(guān)節(jié)膠囊對兔膝骨關(guān)節(jié)病體重的影響

經(jīng)t檢驗(yàn)，低、中、高劑量組體重變化與模型組相比，無顯著性差異，提示健步關(guān)節(jié)膠囊毒性較低或無毒性作用，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 健步關(guān)節(jié)膠囊對兔子體重的影響(ˉx±s，n=6)

3.2 健步關(guān)節(jié)膠囊對兔膝骨關(guān)節(jié)病血清NO含量的影響健步關(guān)節(jié)膠囊低、中、高劑量組均能不同程度提高兔膝關(guān)節(jié)病血清中NO的含量，同模型組相比，中劑量組有極顯著差異(P＜0.01)。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 健步關(guān)節(jié)膠囊對兔膝骨關(guān)節(jié)病血清NO含量的影響(ˉx±s，n=6)

3.3 健步關(guān)節(jié)膠囊對兔膝骨關(guān)節(jié)病血清SOD含量的影響健步關(guān)節(jié)膠囊中、高劑量組血清SOD活力較模型組均顯著升高，陽性藥和低劑量組的SOD活力均數(shù)較模型組高，但無顯著性差異。提示健步關(guān)節(jié)膠囊對血清SOD活性的升高作用強(qiáng)于陽性藥硫酸氨基葡萄糖。具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 健步關(guān)節(jié)膠囊對兔膝骨關(guān)節(jié)病血清SOD含量的影響(ˉx±s，n=6)

3.4 組織學(xué)觀察可見模型組軟骨呈變性改變，滑膜增生，充血，且表層可見較多炎細(xì)胞浸潤;健步關(guān)節(jié)低劑量組表層亦有較多炎細(xì)胞浸潤，但隨著劑量增加，可見炎細(xì)胞浸潤逐漸減少，見圖1。表明健步關(guān)節(jié)膠囊對實(shí)驗(yàn)性家兔骨關(guān)節(jié)病有一定的改善作用。

圖1 健步關(guān)節(jié)膠囊對家兔骨關(guān)節(jié)病模型的

4 討論

本方選用淫羊藿、生地、山茱萸、杜仲、楮實(shí)子、川芎、延胡索、牛膝、制香附、路路通10味中藥組方，其中主用淫羊藿、生地以補(bǔ)腎益精，加山茱萸、杜仲、楮實(shí)子更能加強(qiáng)補(bǔ)腎，填骨髓，再加入川芎、延胡索具有活血化瘀、輔以牛膝、制香附引藥下行，行氣解郁，路路通則通行十二經(jīng)穴，共同達(dá)到補(bǔ)益肝腎，活血化瘀止痛、強(qiáng)筋骨之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，含有淫羊藿和生地的補(bǔ)腎壯骨中藥能顯著提高去勢大鼠骨小梁體密度和面密度，增加成骨細(xì)胞體密度和數(shù)密度，抑制破骨細(xì)胞體密度和數(shù)密度，提示淫羊藿和生地作為補(bǔ)腎壯骨中藥的主要藥材可能通過抑制骨吸收，促進(jìn)骨組織形成的作用預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)退行性病變［2］。

傳統(tǒng)治療骨關(guān)節(jié)病使用非甾體類抗炎藥，此類藥物對骨關(guān)節(jié)病患者的炎性癥狀，如關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及活動(dòng)受限等有較好的治療作用，但是非甾體類抗炎藥對軟骨基質(zhì)的合成有抑制作用，長期應(yīng)用雖可改善關(guān)節(jié)疼痛，但骨關(guān)節(jié)病的基本病理變化會加重，導(dǎo)致關(guān)節(jié)過度使用而加重軟骨損傷。硫酸氨基葡萄糖可減輕關(guān)節(jié)疼痛的癥狀，減緩和改變骨關(guān)節(jié)的病理進(jìn)程。其作用機(jī)制是硫酸氨基葡萄糖形成的蛋白聚糖膠體復(fù)合物附著在基質(zhì)膠原網(wǎng)架上，與膠原網(wǎng)架結(jié)構(gòu)構(gòu)成一個(gè)彈性體，起承載壓力、傳導(dǎo)和緩沖應(yīng)力、保護(hù)軟骨結(jié)構(gòu)和軟骨下骨的作用［3～5］，是目前治療骨關(guān)節(jié)退行性病的常規(guī)治療藥物，所以本實(shí)驗(yàn)選擇硫酸氨基葡萄糖膠囊作為陽性對照藥。

氧自由基對生物體有較大的破壞作用，它對氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾，改變其結(jié)構(gòu)和功能，并增加對蛋白水解酶的敏感性，促進(jìn)其降解，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，因而成為許多疾病的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)氧自由基可抑制軟骨細(xì)胞DNA、基質(zhì)蛋白多糖及膠原的合成，促進(jìn)后兩者的降解，同時(shí)引起細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重?fù)p傷［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，健步關(guān)節(jié)膠囊能提高血清SOD的活性，提示其可能通過提高SOD的活性，增強(qiáng)清除體內(nèi)過多氧自由基的能力，從而抑制氧自由基對軟骨細(xì)胞、基質(zhì)蛋白多糖及膠原的損害作用，保護(hù)軟骨和基質(zhì)，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變，防止膝骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)一步發(fā)展。NO可抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，抑制軟骨細(xì)胞膠原的合成，促使其分解，這些變化可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)能力下降，增加軟骨破壞，加速軟骨退變［7］。但也有人持不同意見。Clements等［8］在骨關(guān)節(jié)病動(dòng)物模型中去除iNOS基因，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨退變加速，認(rèn)為NO可能對維持軟骨基質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。表明NO在軟骨基質(zhì)中可能存在復(fù)雜的雙重作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，健步關(guān)節(jié)膠囊能夠提高兔膝關(guān)節(jié)病血清NO的含量，提示，健步關(guān)節(jié)膠囊可能是通過穩(wěn)定和維持軟骨機(jī)制的內(nèi)環(huán)境而發(fā)揮作用。

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The effect of Jianbu Guanjie Capusule on level of correlative ingredients in osteoarthropathy model of rabbit

BAO Lei-lei，CHEN Hai-fei，BIAN Jun，YUAN Bing(Department of Pharmacy，NO.411 Hospital of PLA，Shanghai 200434，China)

ObjectiveTo discuss the protection and mechanism of Jianbu Guanjie Capusule(JBGJ capsule)to the knee osteoarthritis of rabbit.MethodsThirty healthy New Zealand rabbits were divided into five groups randomly with parallel control methods.The five groups were model group，positive group，low dose group，middle dose group and high dose group，respectively.The osteoarthropathy of knee joint model was built according to the Japanese KangYan standard.The rabbits were given the drug in the next day after the model establishment.After six weeks，animal serum and slippery membranes were collected to be detected.ResultsThe activity of SOD in serum was improved in the middle，high dose group and positive group，which had significant different with the model group(P＜0.05).The nitric oxide(NO)in serum was raised in low，middle and high dose group.The middle dose group had significant different with the model group.ConclusionJBGJ capsule could improve the activity of Superoxide dismutase(SOD)in serum and the level of NO，which could obviously improved the pathological alteration in osteoarthropathy model of rabbit.

Jianbu Guanjie capsule;osteoarthrosis;NO;SOD

R956.2

A

1006－0111(2012)03－0211－03

10.3969/j.issn.1006－0111.2012.03.014

2012-03-09

［修回日期］2012-04-11

上海市虹口區(qū)衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研資助重點(diǎn)項(xiàng)目(0702-16-151號).

鮑蕾蕾(1979-)，女，碩士，主管藥師.Tel:(021) 65283984，E-mail:annabao212@hotmail.com.