馬 燕， 林寶琴， 李衛(wèi)中， 胡曉峰

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006;2.慧谷醫(yī)藥有限公司，廣東廣州 510610)

柚皮素是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物。國(guó)內(nèi)關(guān)于柚皮素的研究主要包括:中藥材和中成藥中柚皮素的定量測(cè)定［1-2］、化學(xué)成分的分離鑒別和提取工藝的研究等［3-4］。國(guó)外關(guān)于柚皮素的研究主要包括藥理作用和藥物動(dòng)力學(xué)兩個(gè)方面［5］。文獻(xiàn)報(bào)道柚皮素具有抑制CYP3A4活性［6-7］，抑制人細(xì)胞色素酶 P450 活性［8］、抗氧化［9］、抗 潰瘍［10］、抑制乳腺癌增殖［11］、抗炎［12］等生理活性。柚皮素還具有很好的鎮(zhèn)咳、化痰、平喘等藥理活性［13］。

雖然柚皮素具有廣泛的藥理活性，但由于其水溶性和脂溶性均不好，口服生物利用度低，尚未應(yīng)用于臨床。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道柚皮素在兔體內(nèi)的生物利用度以游離柚皮素計(jì)僅為4%，以酶解后柚皮素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)為8%［14］。因此需要深入研究柚皮素的口服吸收機(jī)制和體內(nèi)過程，尤其在新藥和藥物制劑的處方前研究中，有必要對(duì)藥物進(jìn)入體內(nèi)的吸收情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。小腸是藥物吸收的主要部位，大鼠在體腸灌流法能很好的模擬人體的體內(nèi)環(huán)境，且結(jié)果與人體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相關(guān)性良好，因此可以減少劑型設(shè)計(jì)的盲目性，為劑型開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BT100—2J恒流泵 (保定蘭格);UV—2100紫外分光光度計(jì) (UNIC上海有限公司);HN—S21CR4恒溫水浴箱 (上海錦屏儀器儀表有限公司)。

1.2 試劑及藥品 柚皮素 (HPLC檢測(cè)純度≥98%，西安慧科植物開發(fā)有限公司，批號(hào):NA20100710);酚紅 (天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào):20100610);Krebs-Ringer緩沖液 (每1 L內(nèi)含NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl20.37 g，MgCl20.22 g，NaH2PO40.22 g，葡萄糖1.4 g和NaHCO31.37 g)自制;其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量 (250±50)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(粵)2008—0020。

2 方法與結(jié)果

2.1 灌流液中柚皮素的含有量測(cè)定方法

2.1.1 柚皮素最大吸收波長(zhǎng)的確定 精密量取1 mg/mL柚皮素貯備液0.2 mL(稱取柚皮素適量，以無水乙醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL柚皮素貯備液)，置于10 mL量瓶中，用 Krebs-Ringer緩沖液定容，得到20.0 μg/mL的柚皮素對(duì)照溶液;量取上述柚皮素對(duì)照溶液2 mL，加入10%氫氧化鈉溶液2 mL，顯色40 min，以Krebs-Ringer液為空白，按分光光度法在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，由圖1可知柚皮素在425 nm有較大吸收，且此波長(zhǎng)下酚紅溶液無干擾，因此選擇425 nm作為柚皮素的測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 柚皮素 (A)和酚紅 (B)的紫外掃描圖譜Fig.1 UV spectrums of naringenin(A)and phenol red(B)

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的柚皮素貯備液 (1 mg/mL)，置于10 mL量瓶中，用Krebs-Ringer緩沖液定容，得到10、20、30、40、50、60 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，加入10%NaOH 2 mL，顯色40 min后，以Krebs-Ringer緩沖液為空白，于425 nm處測(cè)定吸光度A值。以質(zhì)量濃度對(duì)吸收度進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.014 6x+0.038(r=0.999 8，n=3)，在10～60 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 柚皮素在腸灌流液中穩(wěn)定性的考察 將大鼠全腸段置于循環(huán)系統(tǒng)中，將Krebs-Ringer緩沖液100 mL灌注于恒流泵中，以2.5 mL/min速率循環(huán)4 h。用循環(huán)后的腸液配制40.0 μg/mL的柚皮素腸灌流液，于37℃水浴放置4 h，在預(yù)定時(shí)間取樣，測(cè)定吸光度值，計(jì)算RSD值為0.75%。結(jié)果顯示柚皮素在腸灌流液中4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 重復(fù)性考察 分別精密量取10、25、40 μg/mL的柚皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，按2.1.2項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度A值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算柚皮素質(zhì)量濃度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示RSD值小于1.97%，重復(fù)性符合方法學(xué)要求。

2.1.5 精密度考察 分別精密量取10、25、40 μg/mL的柚皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，按2.1.2項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度A值。日內(nèi)測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算rfjg濃度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明日內(nèi)和日間RSD值分別為1.15%和1.28%。

2.1.6 回收率考察 精密量取柚皮素對(duì)照品貯備液 (1 mg/mL)0.1、0.2、0.4 mL置于10 mL量瓶中，用 Krebs-Ringer緩沖液稀釋，定容至10，20，40 μg/mL的柚皮素溶液，按2.1.2項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量濃度，求得平均回收率為99.68%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%。見表1。

表1 柚皮素回收率結(jié)果Tab.1 Analytical recovery for determination of naringenin by UV(n=5)

2.2 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用Krebs-Ringer液配制質(zhì)量濃度為10、15、20、25、30、40 μg/mL的系列濃度酚紅溶液，分別精密吸取1 mL，加入1 mol/mL NaOH溶液10 mL，顯色5 min。以Krebs-Ringer液為空白，在560 nm測(cè)定吸收度，以吸光度對(duì)酚紅質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.017 7x-0.009 4(r=0.999 3，n=3)，酚紅在10～40 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 大鼠在體腸灌流實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)操作［15］手術(shù)前大鼠禁食18 h，自由飲水，稱定質(zhì)量，以3%戊巴比妥鈉溶液0.15 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后將大鼠背位固定于手術(shù)臺(tái)板上，沿腹部正中線切開腹部 (約3 cm)。對(duì)需要觀察的部分，在兩端剪切后插管，結(jié)扎，裝好恒流泵循環(huán)裝置。先用少量37℃的生理鹽水沖洗腸段，再用空氣將溶液排凈。接著以10 mL空白灌流液灌注腸道，之后將含有藥物和酚紅 (20.0 μg/mL)的100 mL灌流溶液注于恒流泵中，開始以5.0 mL/min體積流量平衡2 min，然后以2.5 mL/min速率灌流。分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h取樣3 mL，同時(shí)補(bǔ)加相同體積的Krebs-Ringer液配制的酚紅溶液(20.0 μg/mL)。

將不同時(shí)間點(diǎn)的樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液2 mL，加入10%NaOH，以Krebs-Ringer液為空白，顯色后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。根據(jù)酚紅的濃度變化校正供試液的體積，準(zhǔn)確計(jì)算腸循環(huán)液中的剩余藥量，以剩余藥量的對(duì)數(shù)值與取樣時(shí)間作圖得一直線，根據(jù)直線斜率求出吸收速率常數(shù)Ka，由4 h剩余藥量的變化值對(duì)零時(shí)刻剩余藥量的比值求出藥物吸收率［16，17］。

2.3.2 濃度對(duì)藥物吸收的影響 用Krebs-Ringer緩沖液配制30.0，40.0，50.0 μg/mL柚皮素溶液(酚紅質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL)，將不同質(zhì)量濃度的供試液經(jīng)大鼠在體整腸段回流4 h后，考察藥物濃度對(duì)吸收的影響，整腸段自十二指腸上端起到回腸下端止。見表2。

表2 不同質(zhì)量濃度柚皮素的吸收率和吸收速率常數(shù)(±s，n=3)Tab.2 Absorption percentage and absorption rate constant of naringenin at different concentration(±s，n=3)

表2 不同質(zhì)量濃度柚皮素的吸收率和吸收速率常數(shù)(±s，n=3)Tab.2 Absorption percentage and absorption rate constant of naringenin at different concentration(±s，n=3)

質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)吸收率/%吸收速率常數(shù)Ka/h-1 30.0 34.24±2.31 0.195±0.002 40.0 38.35±2.20 0.203±0.006 50.0 43.61±0.16 0.211±0.009

表2結(jié)果表明，柚皮素供試液在大鼠小腸回流4 h后，吸收率和吸收速率常數(shù)隨質(zhì)量濃度的增加而依次遞增。將吸收量對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸得方程Q=0.47C+19.9(r=0.997 3)，柚皮素的吸收量與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系。對(duì)吸收率和吸收速率常數(shù)進(jìn)行方差分析，比較不同藥物質(zhì)量濃度對(duì)藥物吸收的影響。結(jié)果顯示不同質(zhì)量濃度下柚皮素的吸收率有顯著性差異 (P＜0.05)，而吸收速率常數(shù)無顯著性差異，提示藥物的吸收以被動(dòng)擴(kuò)散為主。

2.3.3 不同腸段對(duì)藥物吸收的影響 采用40.0 μg/mL柚皮素供試液分別在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸4個(gè)腸段回流，考察大鼠各腸段的吸收情況。分段考察的各腸段區(qū)間如下:十二指腸段自幽門1 cm處開始往下10 cm止;空腸段自幽門15 cm起往下10 cm止;回腸段自盲腸上行20 cm開始往下10 cm止;結(jié)腸段從盲腸后端開始往下10 cm止。供試液經(jīng)不同腸段循環(huán)回流4 h后，小腸對(duì)藥物的吸收率和吸收速率常數(shù)Ka見表3。

表3 不同腸段柚皮素的吸收率和吸收速率常數(shù)(±s，n=3)Tab.3 Absorption percentage and absorption rate constant of naringenin at different intestines segments(±s，n=3)

表3 不同腸段柚皮素的吸收率和吸收速率常數(shù)(±s，n=3)Tab.3 Absorption percentage and absorption rate constant of naringenin at different intestines segments(±s，n=3)

大鼠腸段 吸收率/% 吸收速率常數(shù)Ka/h -1十二指腸15.96±0.25 0.101±0.008空腸 12.67±0.78 0.085±0.011回腸 7.42±1.43 0.063±0.009結(jié)腸5.46±0.51 0.035±0.013

結(jié)果表明，柚皮素供試液在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的吸收率和吸收速率常數(shù)依次遞減，即十二指腸＞空腸＞回腸＞結(jié)腸，且有顯著性差異(P＜0.05)。以剩余藥量的對(duì)數(shù)值對(duì)時(shí)間t進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)r均大于0.950 0，表明在各腸道藥物的吸收符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程。

2.3.4 膽汁分泌對(duì)藥物吸收的影響 將大鼠分為結(jié)扎膽管和不結(jié)扎膽管的兩組，分別進(jìn)行整腸段回流實(shí)驗(yàn)，考察膽管排泄對(duì)40.0 μg/mL柚皮素吸收的影響。供試液經(jīng)大鼠在體腸循環(huán)回流吸收試驗(yàn)4 h后，結(jié)扎和未結(jié)扎膽管的小腸對(duì)藥物的吸收率和吸收速率常數(shù)Ka見表4。結(jié)果表明，未結(jié)扎膽管大鼠的吸收率和吸收速率常數(shù)均高于結(jié)扎組，且有顯著性差異 (P＜0.05)。

表4 膽汁分泌對(duì)柚皮素吸收率和吸收速率常數(shù)的影響 (±s，n=3)Tab.4 Effects of bile secretion on the absorption percentage and absorption rate constant of naringenin(±s，n=3)

表4 膽汁分泌對(duì)柚皮素吸收率和吸收速率常數(shù)的影響 (±s，n=3)Tab.4 Effects of bile secretion on the absorption percentage and absorption rate constant of naringenin(±s，n=3)

膽管結(jié)扎情況 吸收率/% 吸收速率常數(shù)Ka/h-1未結(jié)扎 38.35±2.20 0.203±0.005結(jié)扎30.77±4.80 0.164±0.004

3 討論

3.1 水的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，小腸在吸收的過程中，不僅吸收藥物也吸收水分，使供試液體積減少，故不能用直接測(cè)定藥物濃度的方法計(jì)算剩余的藥量。本實(shí)驗(yàn)采用在腸道pH值條件下不被吸收的弱酸性藥物酚紅標(biāo)示回流液體積的變化，從而可較準(zhǔn)確的求算藥物的吸收量［18］。

3.2 由于大鼠的生理結(jié)構(gòu)中沒有膽囊，輸膽管開口于十二指腸的上端，分泌的膽汁直接進(jìn)入十二指腸。膽汁中的主要成分膽汁酸具有良好的表面活性作用，能夠改善藥物的溶解性能，并通過增加生物膜的通透性促進(jìn)具有特殊吸收機(jī)制的藥物吸收。

3.3 柚皮素為二氫黃酮類化合物，定量測(cè)定時(shí)通過加入顯色劑10%NaOH顯色后，再采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，可以很好的避免腸液的干擾性，而且此法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、易行。

3.4 本實(shí)驗(yàn)從藥物吸收動(dòng)力學(xué)，藥物質(zhì)量濃度，不同腸段及膽汁分泌等方面探討了柚皮素的吸收機(jī)理:①在30～50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，柚皮素的吸收量與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系 (r=0.997 3)，吸收量隨藥物質(zhì)量濃度的增加而增加，無高濃度飽和現(xiàn)象，吸收速率常數(shù)Ka基本不變;②在對(duì)藥物于不同腸段吸收情況的考察中，以剩余藥量的對(duì)數(shù)值對(duì)時(shí)間t進(jìn)行線性回歸，各回歸直線均有r＞0.950 0，表明在腸道各部位藥物的下降與循環(huán)時(shí)間呈線性關(guān)系，故為一級(jí)吸收動(dòng)力學(xué);③由膽汁分泌對(duì)吸收的影響試驗(yàn)結(jié)果可知，在結(jié)扎膽管的大鼠和未結(jié)扎膽管的大鼠小腸對(duì)柚皮素的吸收存在顯著性差異，說明膽汁的分泌影響藥物的吸收，也有可能與柚皮素的肝腸循環(huán)有關(guān)［19］。綜上所述，初步推測(cè)柚皮素在腸內(nèi)的吸收主要為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)方式。

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