龍 彥，李俊霞，馮珍如，邢凌生，李志艷，柏明見(jiàn)，王美玲，閆存林，鄭新芝

潰瘍性結(jié)腸炎 (UC)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病機(jī)制尚未明確。其臨床特點(diǎn)是緩解期和活動(dòng)期交替發(fā)作，維持緩解狀態(tài)和預(yù)防復(fù)發(fā)是治療本病的關(guān)鍵［1］。疾病活動(dòng)性的準(zhǔn)確判斷是制定合理的治療方案、監(jiān)測(cè)治療效果及判斷預(yù)后的重要依據(jù)［2］。目前尚無(wú)判斷UC疾病活動(dòng)性的“金標(biāo)準(zhǔn)”，臨床以 Mayo疾病活動(dòng)指數(shù)(UCAI)使用最為廣泛，但其需綜合患者臨床癥狀等多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行判斷，具有一定的主觀性;內(nèi)鏡判斷UC準(zhǔn)確、可靠，但因其為有創(chuàng)檢查，患者常難以接受;實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)血清C-反應(yīng)蛋白 (CRP)和紅細(xì)胞沉降率 (ESR)等均為非特異炎性指標(biāo)。嗜酸粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白 (ECP)是嗜酸粒細(xì)胞的主要顆粒成分之一，是嗜酸粒細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)［3］，在糞便標(biāo)本中相對(duì)穩(wěn)定且檢測(cè)方法相對(duì)成熟［4］。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道ECP與UC活動(dòng)性相關(guān)，但目前未達(dá)成共識(shí)［2，4-11］;筆者未檢索到國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定不同活動(dòng)期UC患者糞便ECP水平并與血清CRP、ESR水平進(jìn)行比較，旨在探討糞便ECP對(duì)UC活動(dòng)性的評(píng)價(jià)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月—2012年4月北京大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科確診的UC患者45例為病例組，其中男25例，女20例;年齡13～80歲，中位年齡42歲?；颊呔?010年世界胃腸病學(xué)組織關(guān)于炎癥性腸病診斷和治療實(shí)踐指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。根據(jù)UCAI、腹瀉次數(shù)、便血情況、黏膜表現(xiàn)及醫(yī)師對(duì)病情的評(píng)定，將患者分為緩解期組和活動(dòng)期組。緩解期組患者19例，其中男11例，女8例;年齡13～56歲，中位年齡39歲?；顒?dòng)期組患者26例，其中男17例，女9例;年齡21～80歲，中位年齡41歲;根據(jù)UCAI將患者分為輕度活動(dòng)5例，中度9例，重度12例。選擇同期本院健康體檢正常者30例為對(duì)照組，其中男19例，女11例;年齡21～83歲，中位年齡42歲;均無(wú)消化道癥狀及消化道疾病史，便常規(guī)正常，便隱血化學(xué)法及免疫法均陰性。病例組和對(duì)照組均排除變態(tài)反應(yīng)疾病及寄生蟲感染病史者。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 糞便標(biāo)本 采用一次性無(wú)菌容器留取患者隨機(jī)糞便標(biāo)本5.0～10.0 g，24 h內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理或-80℃保存，預(yù)處理前室溫復(fù)融。

1.2.2 糞便標(biāo)本預(yù)處理 (1) 稱取糞便標(biāo)本0.1～1.5 g，按1∶4(體積)比例用提取緩沖液稀釋，充分混勻2 min，使其成懸浮液; (2)吸取混懸液1.0 ml于 EP管中，4℃，20 800 g離心30 min，棄去上清，稱取剩余半固體質(zhì)量; (3)吸取剩余混懸液50 μl用提取緩沖液稀釋至1.5 ml，充分混勻，4℃放置30 min，4℃，20 800 g離心30 min，留取上清液待測(cè)，標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)測(cè)定; (4)采用瑞典ImmunoCAP250酶免分析儀，熒光酶免法定量檢測(cè)，將測(cè)得非糞便ECP水平(μg/L)換算為半固體質(zhì)量 (μg/g)，以消除患者糞便性狀對(duì)結(jié)果的影響。糞便ECP提取緩沖液配置:0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.4，10 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA·Na2)，0.2%十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)，20%甘油，0.05%吐溫20，1%小牛血清清蛋白。

1.2.3 血清標(biāo)本 采集患者清晨空腹肘靜脈血3 ml，置于分離膠真空采血管，2 h內(nèi)3 000 r/min，離心半徑5 mm離心10 min，留取患者血清，24 h內(nèi)或-80℃保存?zhèn)溆?，用于血清CRP檢測(cè);同時(shí)采集患者清晨空腹靜脈血2.7 ml，與枸櫞酸鹽抗凝劑以1∶9比例混勻，置于抗凝真空采血管，用于ESR檢測(cè)。

1.3 主要儀器及試劑 Sartorius BP211D分析天平，SIGMA 3k15高速離心機(jī)，BECKMAN COULTER Allegra X-22R普通離心機(jī)，1 000 μl、100 μl加樣器，1.5 ml EP 管，一次性無(wú)菌標(biāo)本盒，瑞典Phadia AB Uppsala Sweden ImmunoCAP250免疫分析儀及配套ECP檢測(cè)試劑盒，MZMY-BX-012 709-80℃冰箱，SAMSUNG BCD-183D 4℃冰箱。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，糞便ECP、血清CRP水平及ESR經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)均呈非正態(tài)分布，以中位數(shù) (四分位數(shù))表示，兩組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;多組間比較采用Bonferroni校正P值后，再分別進(jìn)行兩組間Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，以P＜0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析 (r值);繪制受試者工作特征 (ROC)曲線并計(jì)算曲線下面積 (AUC)及Youden's指數(shù)，評(píng)價(jià)各指標(biāo)判斷UC疾病活動(dòng)性的診斷效能。

2 結(jié)果

2.1 各組糞便ECP和血清CRP水平及ESR比較 各組糞便ECP水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.000);其中活動(dòng)期組糞便ECP水平高于緩解期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值為0.00，P＜0.05);緩解期組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值為0.00，P＜0.05)。各組血清CRP水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.002);其中活動(dòng)期組血清CRP水平高于緩解期組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值為0.376，P＞0.05);緩解期組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值為0.001，P＜0.05)。各組血清 ESR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.012);其中活動(dòng)期組血清ESR高于緩解期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值為0.013，P＜0.05)，緩解期組低于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值為0.097，P＞0.05，見(jiàn)表1)。

表1 各組糞便ECP和血清CRP水平及ESR比較〔中位數(shù) (四分位數(shù))〕Table 1 Comparison of fecal ECP，serum CRP levels and ESR in patients in each group

2.2 不同活動(dòng)度活動(dòng)期UC患者糞便ECP和血清CRP水平及ESR比較 不同活動(dòng)度活動(dòng)期UC患者糞便ECP水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.012);其中輕度活動(dòng)組與重度活動(dòng)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.002);輕度活動(dòng)組與中度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組與重度活動(dòng)組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.019和0.095)。不同活動(dòng)度活動(dòng)期UC患者血清CRP水平和ESR比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.017，見(jiàn)表2)。

表2 不同活動(dòng)度活動(dòng)期UC患者糞便ECP和血清CRP水平及ESR比較〔中位數(shù) (四分位數(shù))〕Table 2 Comparison of fecal ECP，serum CRP levels and ESR in patients with different disease activity

2.3 糞便ECP水平與UCAI的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，糞便 ECP水平與 UCAI呈正相關(guān) (r=0.809，P=0.000，見(jiàn)圖1)。

圖1 糞便ECP水平與UCAI的相關(guān)性分析Figure 1 Correlation of fecal ECP and UCAI

2.4 糞便ECP和血清CRP及ESR判斷UC疾病活動(dòng)性的診斷效能比較 糞便ECP判斷UC疾病活動(dòng)性的AUC為0.939，標(biāo)準(zhǔn)誤為 0.033，95%CI為 (0.875，1.004); 血清 CRP 判斷UC疾病活動(dòng)性的AUC為0.578，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.088，95%CI為(0.405，0.751);血清 ESR判斷 UC疾病活動(dòng)性的 AUC為0.721，標(biāo)準(zhǔn)誤為 0.078，95%CI 為 (0.568，0.873，見(jiàn)圖2)。當(dāng)糞便 ECP水平為52.41 μg/g時(shí)，Youden's指數(shù)最高(1.779)，即判斷UC疾病活動(dòng)性的診斷效能最好。

圖2 糞便ECP和血清CRP及ESR判斷疾病活動(dòng)性的ROC曲線Figure 2 The ROC curve of fecal ECP，serum CRP and ESR evaluating the disease activity of UC patients

3 討論

目前尚無(wú)判斷UC疾病活動(dòng)性的“金標(biāo)準(zhǔn)”，UCAI能較全面地反映疾病的活動(dòng)程度，是目前臨床應(yīng)用最廣且較為簡(jiǎn)單的疾病活動(dòng)度評(píng)分系統(tǒng)，由2010年《對(duì)我國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)》推薦使用，但其需綜合患者臨床癥狀等多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行判斷，具有一定的主觀性;內(nèi)鏡檢查因其有創(chuàng)而不易被患者接受;實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)血清CRP、ESR對(duì)UC活動(dòng)程度判斷特異性較低，尤其是當(dāng)患者合并腸道內(nèi)感染時(shí)，且ESR受很多因素的影響。因此，臨床迫切需要一種理想的標(biāo)記物，能快速、簡(jiǎn)便、敏感且特異地反映UC的病情活動(dòng)。

ECP是嗜酸粒細(xì)胞顆粒的主要成分之一，最先由Olsson等［3］于1972年從慢性粒細(xì)胞白血病患者白血病細(xì)胞分離，富含精氨酸及鋅指結(jié)構(gòu)，分子量為16～22 kDa，等電點(diǎn)10.8，具有細(xì)胞毒性和免疫調(diào)節(jié)作用，是嗜酸粒細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)。研究證明，腸道黏膜嗜酸粒細(xì)胞激活與多種消化道疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如嗜酸粒細(xì)胞性胃腸炎［10］，膠原性腸?。?1］及 UC 等［4-11］，且能反映疾病的活動(dòng)性。

Peterson等［8］研究發(fā)現(xiàn)，UC患者腸道黏膜病理內(nèi)鏡下可見(jiàn)嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加，Bischoff等［10］通過(guò)免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，UC患者腸道黏膜細(xì)胞間隙ECP沉積增加，Peterson等［4］和Kristjánsson等［5］檢測(cè)UC患者腸道灌洗液和糞便標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，其ECP水平明顯升高。這些研究均提示ECP有望成為反映腸道炎癥的可靠標(biāo)記物。

本研究結(jié)果顯示，各組糞便ECP水平間差異有顯著性，且活動(dòng)期組糞便ECP水平高于緩解期組，緩解期組高于對(duì)照組，差異均有顯著性，與Peterson等［4］研究結(jié)果一致。不同活動(dòng)度活動(dòng)期UC患者糞便ECP水平差異有顯著性，且輕度活動(dòng)組與重度活動(dòng)組糞便ECP水平差異有顯著性，輕度活動(dòng)組與中度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組與重度活動(dòng)組糞便ECP水平差異均無(wú)顯著性。分析可能與嗜酸粒細(xì)胞參與UC腸道活動(dòng)期炎癥反應(yīng)，但并非主導(dǎo)其活動(dòng)度的主要因素有關(guān)，也可能與本研究樣本量較小有關(guān)，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行證實(shí)。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，糞便ECP水平與UCAI呈正相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致;通過(guò)繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，糞便ECP的AUC明顯大于血清CRP和ESR，當(dāng)糞便ECP水平為52.41 μg/g時(shí)，判斷UC疾病活動(dòng)性的診斷效能最好。

臨床處于緩解期的UC患者可能仍有“輕微”或“局限性”黏膜炎癥存在，易導(dǎo)致復(fù)發(fā)，但內(nèi)鏡檢查對(duì)此類“輕微”或“局限性”黏膜炎癥漏檢率較高。Lampinen等［9］通過(guò)對(duì)UC患者腸道黏膜洗脫細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，緩解期UC患者腸道黏膜未激活嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于活動(dòng)期組和健康對(duì)照組。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分UC緩解期患者糞便ECP水平升高不明顯，但病理組織活檢仍可見(jiàn)大量嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，提示緩解期UC患者部分存在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道緩解期UC患者嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加可能與腸道黏膜上皮修復(fù)和纖維化過(guò)程有關(guān)［10］。因此，臨床上發(fā)現(xiàn)UC緩解期患者糞便ECP水平輕度升高應(yīng)引起重視，以預(yù)防疾病復(fù)發(fā)。

此外，Shichijo等［12］采用抗ECP抗體促進(jìn)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎腸道黏膜上皮再生并下調(diào)腸道黏膜免疫反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎緩解。明確ECP在UC發(fā)病機(jī)制中的作用有助于為臨床提供更有效的UC治療方法，有待進(jìn)行更多臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，糞便ECP與UCAI有很好的相關(guān)性，診斷效能優(yōu)于血清CRP和ESR，有助于臨床判斷UC活動(dòng)性，但對(duì)活動(dòng)期患者活動(dòng)度的判斷價(jià)值有限;可作為一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、靈敏、無(wú)創(chuàng)的生物標(biāo)記物用于監(jiān)測(cè)UC活動(dòng)性。

1 Bernstein CN，F(xiàn)ried M，Krabshuis JH，et al.World Gastroenterology Organization Practice Guidelines for the diagnosis and management of IBD in 2010 ［J］.Inflamm Bowel Dis，2010，16(1):112-124.

2 James D，Lewis.The utility of biomarkers in the diagnosis and therapy of inflammatory bowel disease ［J］.Gastroenterology，2011，140(6):1817-1826.

3 Venge P，Bystr?m J，Carlson M，et al.Eosinophil cationic protein(ECP):molecular and biological properties and the use of ECP as a marker of eosinphil activation in disease ［J］.Clin Exp Allergy，1999，29(9):1172-1186.

4 Peterson CG，Eklund E，Taha Y，et al.A new method for the quantification of neutrophil and eosinophil cationic proteins in feces:establishment of normal levels and clinical application in patients with inflammatory bowel disease ［J］.Am J Gstroenterol，2002，97(7):1755-1762.

5 Kristjánsson G，Venge P，Wanders A，et al.Clinical and subclinical intestinal inflammation assessed by the mucosal patch technique:studies of mucosal neutrophil and eosinophil activation in inflammatory bowel diseases and irritable bowel syndrome ［J］.Gut，2004，53(12):1806-1812.

6 Saitoh O，Kojima K，Sugi K，et al.Fecal eosinophil granule-derived proteins reflect disease activity in inflammatory bowel disease［J］.Am J Gastroenterol，1999，94(12):3513-3520.

7 Desreumaux P，Nutten S，Colombel JF，et al.Activated eosinophils in inflammatory bowel disease:do they matter? ［J］.Am J Gastroenterol，1999，94(12):3396-3398.

8 Peterson CG，Sangfelt P，Wagner M，et al.Fecal levels of leukocyte markers reflect disease activity in patients with ulcerative colitis［J］.Scand J Clin Lab Invest，2007，67(8):810-820.

9 Lampinen M，R?nnblom A，Amin K，et al.Eosinophil granulocytes are activated during the remission phase of ulcerative colitis ［J］.Gut，2005，54(12):1714-1720.

10 Bischoff SC，Mayer J，Nguyen QT，et al.Immunohistological assessment of intestinal eosinophil activation in patients with eosinophilic gastroenteritis and inflammatory bowel disease ［J］.Am J Gastroenterol，1999，94(12):3531-3539.

11 Sangfelt P，Carlson M，Th?rn M，et al.Neutrophil and eosinophil granule proteins as markers of response to local prednisolone treatment in distal ulcerative colitis and proctitis ［J］.Am J Gastroenterol，2001，96(4):1085-1090.

12 Shichijo K，Makiyama K，Wen CY，et al.Antibody to eosinophil cationic protein suppresses dextran sulfate sodiuminduced colitis in rats［J］.World J Gastroenterol，2005，11(29):4505-4510.