王曉燕

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南鄭州450003)

老年咳喘片是由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、甘草、黃精、淫羊藿、補(bǔ)骨脂等7味中藥組成，具有滋陰壯陽(yáng)、扶正固本、提高免疫能力、促進(jìn)病體康復(fù)的功效，用于老年慢性支氣管炎及各種體虛癥［1］。原標(biāo)準(zhǔn)收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第九冊(cè)，無(wú)定量檢測(cè)方法。淫羊藿和補(bǔ)骨脂是方中用量較大的重要藥物。淫羊藿屬植物的化學(xué)成分目前報(bào)道有70多種，主要是黃酮類，如淫羊藿苷。淫羊藿苷除具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效外，還有鎮(zhèn)咳、祛痰與平喘作用［2］。王淑云［3］研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂中的香豆素類可明顯提高過(guò)敏性哮喘閾，對(duì)哮喘有明顯的拮抗作用。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素即屬呋喃香豆素類成分。有關(guān)老年咳喘片中淫羊藿苷的含量測(cè)定［4－5］及補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定均有報(bào)道［6］?，F(xiàn)建立本品中補(bǔ)骨脂和淫羊藿兩味藥材的檢測(cè)方法，同時(shí)測(cè)定淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，以快速有效地控制老年咳喘片的質(zhì)量。

1 藥品、試劑與儀器

老年咳喘片，鄭州羚銳制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)110104，110105，110106。淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)110737－200114)、補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(批號(hào)110739－200613)、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(批號(hào)110738－200309)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，均為含量測(cè)定用;水為高純水。Waters 2690高效液相色譜儀，Waters 996二極管陣列檢測(cè)器，均為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品;M32色譜工作站。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

HypersIL C18柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm)，柱溫40℃，流動(dòng)相為乙腈－1g/L磷酸(30∶70)，體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂對(duì)照品適量，制成含量分別為 0.132 8，0.036 6，0.037 8 g/L的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品40片，除去薄膜衣，研細(xì)。取約5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量;置水浴上加熱回流40 min，放冷;再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液3，5，7，10，15，20 μL，分別注入液相色譜儀，按上述條件分別測(cè)定峰面積積分值，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸處理。結(jié)果:淫羊藿苷進(jìn)樣量在0.398 4～2.656 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為 Y=1.626×106X －37 402，r=0.999 7;補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量在0.109 8～0.732 0 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=3.012×106X－24 186，r=0.999 7;異補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量在0.113 4～0.756 0 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=3.60×106X －33 556，r=0.999 8。

2.5 陰性對(duì)照試驗(yàn)

分別取方中缺淫羊藿和補(bǔ)骨脂外其他藥物，按老年咳喘片處方比例和工藝分別制備缺淫羊藿和缺補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照物，按供試液制備方法制成缺淫羊藿陰性對(duì)照液和缺補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照液。分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析，見(jiàn)圖1。結(jié)果:供試品溶液色譜中，在與淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上有吸收峰，而缺淫羊藿和缺補(bǔ)骨脂陰性對(duì)照溶液則在相應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)吸收峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，其他藥物對(duì)含量測(cè)定無(wú)影響。

圖1 含量測(cè)定HPLC色譜圖

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào)110104的樣品，按上述方法制備供試品溶液，吸取10 μL，分別在 0，2，4，6，8 h 注入液相色譜儀，測(cè)其峰面積，取8 h的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果:淫羊藿苷的平均峰面積為2 032 098，RSD=0.43%;補(bǔ)骨脂素的平均峰面積為614 933，RSD=0.32%;異補(bǔ)骨脂素的平均峰面積為1010 723，RSD=0.29%。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果:淫羊藿苷平均峰面積為2 014 610，RSD=1.21%;補(bǔ)骨脂素平均峰面積為609 852，RSD=1.28%;異補(bǔ)骨脂素平均峰面積為1 009 521，RSD=1.18%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(批號(hào)110104)，制備6份供試品溶液，按上述方法重復(fù)平行測(cè)定。結(jié)果:淫羊藿苷平均含量為0.631 mg/g，RSD為2.01%;補(bǔ)骨脂素平均含量為0.118 9 mg/g，RSD為2.32%;異補(bǔ)骨脂素平均含量為0.145 mg/g，RSD為2.29%。

2.9 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(淫羊藿苷含量為0.631 mg/g，補(bǔ)骨脂素含量為0.118 9 mg/g，異補(bǔ)骨脂素含量為0.145 0 mg/g)，研細(xì)，取約2.5 g，精密稱定;精密加入淫羊藿苷對(duì)照品約1.5 mg，補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液(0.366 g/L)和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液(0.378 g/L)各1 mL及甲醇23.0 mL;按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，制成加樣供試品溶液。吸取加樣供試液10 μL，注入液相色譜儀，按上述方法測(cè)定加樣供試液中含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1～3。

表1 淫羊藿苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 補(bǔ)骨脂素回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 異補(bǔ)骨脂素回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定

取3批樣品，按2.3項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，依法測(cè)定，重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果 n=3

3 討論

在本試驗(yàn)中，曾試用甲醇 －水(50∶5 0)，甲醇－1 g/L磷酸溶液(50∶50)、乙腈－1 g/L磷酸溶液(40∶60)、乙腈－1 g/L磷酸溶液(35∶65)、乙腈－1 g/L磷酸溶液(30∶70)等條件，經(jīng)反復(fù)比較，最終確定乙腈－1g/L磷酸溶液(30∶70)為最佳色譜條件，色譜重復(fù)性好，3種待測(cè)成分出峰時(shí)間適宜，峰形對(duì)稱，且與相鄰峰分離度較好。

筆者對(duì)提取方法和提取時(shí)間也進(jìn)行了考察。分別用乙醇超聲、乙醇回流和甲醇回流進(jìn)行提取制備的供試品，測(cè)定含量結(jié)果顯示，甲醇回流提取待測(cè)成分含量最高。分別測(cè)定了回流提取30，40，50 min制備的供試品，結(jié)果顯示，提取40 min制備的供試品溶液含量最高，加熱回流50 min時(shí)各成分含量明顯下降。因此，最終選擇甲醇加熱回流40 min的提取方法制備供試品溶液。

本實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素色譜峰進(jìn)行吸收光譜掃描，結(jié)果淫羊藿苷在270 nm下有最大吸收，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在246 nm下有最大吸收。此與2010版《中國(guó)藥典》一部中淫羊藿和補(bǔ)骨脂藥材項(xiàng)下的測(cè)定波長(zhǎng)一致。因此，選擇 0 ～15 min、270 nm 和15 ～25 min、246 nm分別作為淫羊藿苷與補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的檢測(cè)波長(zhǎng)。采用M32色譜工作站的定時(shí)波長(zhǎng)功能，選取15 min為檢測(cè)波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換點(diǎn)，使檢測(cè)波長(zhǎng)由270 nm變?yōu)?46 nm，在同一色譜條件下同時(shí)檢測(cè)本品中淫羊藿苷和補(bǔ)骨脂素類成分。此法不僅可以用于DAD檢測(cè)器，也可用于普通的多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，具有普遍適用性，方便快速。

采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定老年咳喘片中淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量，方法簡(jiǎn)便、快捷、重現(xiàn)性好，可更科學(xué)、更全面的對(duì)老年咳喘片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑:第九冊(cè)［S］.1994:70.

［2］李花.淫羊藿藥理作用的研究現(xiàn)狀及展望［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24(22):3413.

［3］王淑云.補(bǔ)骨脂的藥理作用研究概況［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(6):1081.

［4］李志紅，付彬，石國(guó)明.高效液相色譜法測(cè)定老年咳喘片中淫羊藿苷含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2010，19(6):28.

［5］劉燦輝，譚浩軍.高效液相色譜法測(cè)定老年咳喘片中淫羊藿苷含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18(18):39.

［6］覃建明，莫文電，譚忠謀.RP－HPLC法測(cè)定老年咳喘片中補(bǔ)骨脂和異補(bǔ)骨脂的含量［J］.世界中醫(yī)藥，2010，5(3):75.