馮東，王丙蓮，*，李雪梅，李大海，劉仲惠

（1.山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟南 250014；2.山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南 250014）

雞精，是以雞肉粉、鮮味劑、淀粉、蔗糖、食鹽等為原料，經(jīng)過配制、混合、造粒、干燥等過程加工而成的一種具有雞肉鮮香風味的調(diào)味品，因其特有的風味而越來越受到廣大消費者的喜愛。目前人們多用雞精做湯料的增味劑，谷氨酸鈉（麩氨酸鈉）是味精的主要成分，也是雞精產(chǎn)品中的主要鮮味物質(zhì)，作為雞精產(chǎn)品的主要原料，其含量一般標示量為35%左右[1]。由于雞精類產(chǎn)品中谷氨酸鈉檢測目前尚無國家標準或行業(yè)標準，而某些企業(yè)標準中也未制定谷氨酸鈉的標準測定方法，雖然相關(guān)標準中谷氨酸鈉主要測定方法有3種—高氯酸滴定法、旋光法和酸度計法[2－5]，但由于雞精成分比味精復(fù)雜得多，其中旋光性和水不溶性物質(zhì)的存在，導(dǎo)致上述方法不適用。而高效液相色譜分析費用昂貴且操作復(fù)雜，因此建立一種切實可行的、適合于雞精中谷氨酸鈉含量的測定方法成為必要。

酶電極分析法是將酶蛋白分子采用交聯(lián)作用固定化制成固定化酶膜，再與電化學(xué)基礎(chǔ)電極相結(jié)合，構(gòu)成酶電極生物傳感器用于特異性底物分析的一項生物技術(shù)。該方法具有專一性高、穩(wěn)定性好、檢測快速而靈敏等特點[6]。酶電極研究起步于20世紀60年代，自2000年以來，生物傳感器技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測[7]、食品安全[8]、軍事[9]和醫(yī)學(xué)[10－11]等方面的應(yīng)用日益廣泛，其用于食品谷氨酸、谷氨酸鈉的檢測研究較少[12]。本研究中，我們采用谷氨酸酶電極分析儀測定雞精中谷氨酸鈉的含量，并對其準確性和穩(wěn)定性進行了評估，通過重現(xiàn)性和回收率等試驗，證明該方法測定結(jié)果準確、高效，具有實際使用意義。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

谷氨酸氧化酶膜：谷氨酸氧化酶SIGMA公司生產(chǎn)，利用戊二醛交聯(lián)法制成固定化酶膜圈，置于冰箱待用；緩沖溶液為0.1 mmol/L，pH=7.2的磷酸緩沖液；采用市售雞精；谷氨酸對照品；其它試劑均為分析純。

SBA－40E生物傳感分析儀由山東省科學(xué)院生物研究所自制。

1.2 測定原理

生物傳感分析儀SBA－40E利用酶促反應(yīng)來定量，其樣品分析原理如下：

SBA－40E生物傳感分析儀結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

樣品室側(cè)面裝有過氧化氫電極，電極表面覆蓋固定化的谷氨酸氧化酶酶膜。含有谷氨酸鈉的底物在樣品室內(nèi)與固定化谷氨酸氧化酶層接觸并反應(yīng)，產(chǎn)生的H2O2由過氧化氫電極檢測并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，該電流信號?jīng)放大處理顯示測定結(jié)果，并自動記錄和打印。因為產(chǎn)生的H2O2的量與谷氨酸質(zhì)量濃度成線性比例關(guān)系，故可測定樣品中谷氨酸含量，進而換算得谷氨酸鈉含量。

酶電極及固定化酶膜結(jié)構(gòu)如圖2所示。

電極系統(tǒng)包括兩個酶電極及其插頭，固定化谷氨酸氧化酶酶層通過酶膜片及O型密封圈固定于酶電極頂端。系統(tǒng)通過固定化酶層實現(xiàn)對谷氨酸、谷氨酸鈉的催化反應(yīng)，生成的H2O2由過氧化氫電極檢測并顯示，從而實現(xiàn)對谷氨酸、谷氨酸鈉的測定。

1.3 方法

1.3.1 谷氨酸標準溶液

準確稱量谷氨酸，蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度依次為0.5、1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL 的谷氨酸標準溶液，密封放置，用于檢驗生物傳感分析儀的線性范圍和檢測靈敏度。

1.3.2 SBA－40E生物傳感分析儀環(huán)境要求

該分析儀需要0.5平方米的工作臺，工作臺平整潔凈，避免日曬。操作環(huán)境溫度要求15℃～35℃，相對濕度低于90%。

1.3.3 測定步驟

1.3.3.1 SBA－40E生物傳感分析儀定標

為保持谷氨酸酶膜活性，系統(tǒng)緩沖劑采用0.1 mmol/L，pH=7.2的磷酸鹽緩沖液。采用100 mg/100 mL谷氨酸溶液作為分析儀定標液。SBA－40E生物分析儀開機后，系統(tǒng)進行自檢，后指示燈提示進樣。用微量進樣器準確吸取25 μL定標液快速注入反應(yīng)室，儀器自行運轉(zhuǎn)，并顯示測定結(jié)果。根據(jù)儀器提示用谷氨酸標準液重復(fù)定標幾次，最終SBA－40E自動定標為100，然后可進行樣品測定。

1.3.3.2 雞精樣品測定

精確稱取適量雞精樣品，蒸餾水使其充分溶解，并按一定比例稀釋，調(diào)整pH為6～8。根據(jù)分析儀“進樣”指示，準確吸取25 μL稀釋的雞精樣品，并注入反應(yīng)池。反應(yīng)20 s后分析儀自行顯示并打印測定結(jié)果，根據(jù)分析儀測定數(shù)值，結(jié)合雞精稀釋倍數(shù)和谷氨酸、谷氨酸鈉換算系數(shù)，即可計算雞精中谷氨酸鈉含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用t檢驗分析，比較液相色譜儀法與SBA－40E生物傳感分析儀測定結(jié)果之間的顯著性差異，判斷SBA－40E生物傳感分析儀能否達到液相色譜儀對谷氨酸鈉檢測的準確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定的最適pH

谷氨酸氧化酶作為一種蛋白質(zhì)，過酸或過堿環(huán)境均導(dǎo)致其活性下降，以致失活，從而嚴重影響SBA－40E分析儀測定的準確度。本試驗采用磷酸鹽緩沖體系，配制pH 1～10的緩沖液，結(jié)果表明，pH7.0左右時谷氨酸氧化酶酶活性最高。鑒于此，SBA－40E生物傳感分析儀系統(tǒng)選用pH7.2的磷酸緩沖液。待測雞精樣品溶液需調(diào)整pH到6～8，強酸或強堿樣品液均將導(dǎo)致谷氨酸氧化酶酶膜失活。

2.2 線性范圍確定

上述試驗條件下，分別測定谷氨酸系列標準溶液（0.5、1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 mg/100 mL），進樣體積25 μL。依據(jù)SBA－40E生物傳感分析儀顯示結(jié)果繪制標準曲線，如圖3。

圖3結(jié)果表明，在1 mg/100 mL～100 mg/100 mL范圍內(nèi)，SBA－40E生物傳感分析儀顯示值與谷氨酸的質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系。谷氨酸質(zhì)量濃度為X，顯示值為Y，線性回歸方程為：y=0.999 19－0.033 2x，相關(guān)系數(shù)R為0.999 86。該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的谷氨酸可由SBA－40E直接檢測。超出該質(zhì)量濃度范圍時，SBA－40E顯示值遠遠偏離回歸曲線，由此可判斷該方法對谷氨酸的檢測下限與檢測上限分別為1mg/100mL、100 mg/100 mL，相應(yīng)的谷氨酸鈉的檢測下限、檢測上限分別為1.27 mg/100 mL、127 mg/100 mL。谷氨酸鈉質(zhì)量濃度高于其檢測上限時需要稀釋測定。

2.3 該方法的回收率檢驗

本研究利用回收試驗進一步驗證該方法的準確性。最佳試驗條件下，取市售3種品牌雞精樣品，稀釋后每個樣品平均分成2份，其中一份加入等體積質(zhì)量百分比濃度為30%的谷氨酸鈉對照溶液做回收試驗。按照“1.3.3”步驟測定各試樣谷氨酸鈉含量。由回收率計算公式：P=（加標試樣測定值－試樣測定值）/加標量×100%，結(jié)果見表1。

表1 加標回收率（n=5）Table 1 Recovery of standard addition（n=5）

由表1中的數(shù)據(jù)可知，用酶電極法測定雞精樣品回收率為99.3%～101.2%，處于98%～102%之間，表明該方法用于雞精中谷氨酸鈉含量的測定準確度較高。

2.4 酶電極法與高效液相色譜法測定雞精谷氨酸鈉含量的對比試驗

取5種雞精樣品，按相應(yīng)倍數(shù)稀釋后，分別用酶電極法、高效液相色譜法（HPLC）、高氯酸滴定法進行谷氨酸鈉含量測定。每個測試重復(fù)6次，試驗結(jié)果如表2所示。

表2 雞精谷氨酸鈉含量對比測試結(jié)果（n=6）Table 2 Comparative test results for sodium glutamate in chicken essence between SBA-40E and HPLC，perchloric acid titration

表2數(shù)據(jù)顯示，測定雞精中谷氨酸鈉含量，酶電極法與高效液相色譜法、高氯酸滴定法相比較無顯著差異（P＞0.05）。綜上表明，采用酶電極法檢測雞精中谷氨酸鈉含量準確度高亦較高，而酶電極法較之液相色譜分析和高氯酸滴定具備操作簡單、成本低廉的優(yōu)勢，故SBA－40E生物傳感分析儀有望代替高效液相色譜、高氯酸滴定法等，成為測定雞精中谷氨酸鈉含量的新方法、新手段。

2.5 該方法的專一性驗證

作為食品添加劑的5′鳥苷酸二鈉、5′肌苷酸鈉、維生素B2、白糊精等與谷氨酸鈉共存于雞精，本試驗驗證了酶電極法對谷氨酸鈉的檢測專一性及其抗干擾能力。配制5′鳥苷酸二鈉、5′肌苷酸鈉、維生素B2、白糊精等干擾物的質(zhì)量濃度為50 mg/100mL的溶液，利用SBA－40E進行含量測定，并以50 mg/100mL的谷氨酸鈉標準液作對比，結(jié)果見表3。

表3 SBA-40E生物傳感器的專一性試驗（n=6）Table 3 Specificity test of the biosensor SBA-40E for sodium glutamate mg/100 mL

由表3可以看出，SBA－40E能夠準確測定溶液中谷氨酸鈉含量，而對其它幾種雞精中的食品添加劑均無明顯響應(yīng)，說明該方法對雞精谷氨酸鈉的專一性較高，用于雞精中谷氨酸鈉含量測定時能有效排除其它常見雜質(zhì)的干擾。

2.6 該方法的重現(xiàn)性

取某品牌雞精樣品分為6份，采用酶電極法對稀釋為100 mg/100 mL的雞精樣品谷氨酸鈉進行測定，觀察SBA－40E的重現(xiàn)性，結(jié)果如表4。

表4 SBA-40E的重現(xiàn)性試驗Table 4 Reproduicibility test of the biosensor SBA-40E %

相對標準偏差（RSD）為0.74%。該試驗結(jié)果證實該方法用于雞精谷氨酸鈉檢測具有較好的重現(xiàn)性。

2.7 該方法的穩(wěn)定性

運用SBA－40E生物傳感分析儀對已知濃度的谷氨酸鈉溶液進行測試，每5天測定1次，每次6個平行，連續(xù)測定3個月，考察分析儀的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)顯示，分析儀測試結(jié)果沒有明顯變化，酶膜活性穩(wěn)定，這說明谷氨酸氧化酶酶膜3個月內(nèi)能保持較高活性，SBA－40E生物傳感器在此期間亦具有良好的穩(wěn)定性。3個月后可通過更換谷氨酸氧化酶酶膜實現(xiàn)酶電極分析儀的繼續(xù)使用。

3 結(jié)論

本研究利用生物傳感技術(shù)建立了SBA－40E型傳感分析儀，創(chuàng)建了簡潔、快速檢測雞精谷氨酸鈉含量的新方法。該方法直接測定雞精中的谷氨酸鈉，無需進行樣品前處理；檢測靈敏度高，檢出下限為1.27 mg/100 mL；加標回收率高，為99.3%～101.2%；檢測速度快，每個樣品測試僅需20 s；檢測專一性強，不受雞精中其他添加劑，5′鳥苷酸二鈉、5′肌苷酸鈉、維生素B2和白糊精等的干擾；重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好；結(jié)果準確可靠，相對標準偏差為0.74%；與高效液相色譜儀等相比較，其測定結(jié)果無顯著差異（P＞0.05）；線性范圍寬，適用于目前絕大部分雞精樣品中的谷氨酸鈉含量測定；且該方法操作簡單，使用成本低，可使用分析純試劑，更適于味精行業(yè)中谷氨酸鈉含量的監(jiān)控。因此，本方法有望代替高效液相色譜法和高氯酸滴定法，成為當前雞精等調(diào)味料生產(chǎn)過程中谷氨酸、谷氨酸鈉等監(jiān)控的新方法。

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