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        血腫穿刺清除術(shù)對大鼠腦出血灶周組織中IL-6、TNF-α 表達的影響

        2012-09-05 01:56:36劉振華張清華趙佳麗王敏忠杜怡峰
        山東醫(yī)藥 2012年34期
        關(guān)鍵詞:注射器造模陽性細胞

        劉振華,張清華,趙佳麗,王敏忠,杜怡峰

        (山東大學附屬省立醫(yī)院,濟南 250021)

        目前,腦出血血腫穿刺清除術(shù)的最佳時機尚無定論。單從手術(shù)角度考慮,血腫抽吸的理想時間為出血后4~8 d,此時血腫大部分液化有利于清除,但血腫對腦組織的壓迫時間過長,腦損傷恢復的可能性小。近年研究[1~3]證實,一些細胞因子或炎癥介質(zhì)與出血性腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),其中以白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)關(guān)系最為密切。2010~2011年,我們觀察了不同時機的血腫穿刺清除術(shù)對大鼠腦出血灶周組織中IL-6、TNF-α表達的影響,旨在為臨床手術(shù)時機的選擇提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠90只,體質(zhì)量260~320 g,購自山東大學實驗動物中心;大鼠腦立體定向儀,微量注射儀(購于瑞沃德生命科技有限公司),微量注射器 (上海高鴿工貿(mào)有限公司);IL-6、TNF-α抗體(均為非結(jié)合多克隆兔抗體)SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 分組與造模 將大鼠隨機分為對照組、模型組和手術(shù)組各30例。模型組和手術(shù)組參照Rosenberg等[4]報道的方法制備大鼠腦出血模型。術(shù)前禁食,自由飲水。用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(350 mg/kg),將其俯臥位固定在立體定向儀上;沿頭皮正中作一長約10 mm切口,暴露前囟;于前囟前0.2 mm中線旁開3 mm處鉆一直徑為0.5 mm的孔,進針深度為5.5 mm(尾殼核位置)。剪尾取血,在8 min內(nèi)緩慢注入自體未抗凝動脈血50 μL;注血結(jié)束留針10 min后緩慢退針,局部用骨蠟封閉后縫合皮膚。對照組手術(shù)過程同上,注射等量生理鹽水。操作均在無菌條件下進行,術(shù)畢將大鼠放回籠中飼養(yǎng),自由活動,進食進水。Bederson評分[5]≥2分者為造模成功。手術(shù)組在造模成功后6、12、24、48、72 h行血腫穿刺清除術(shù)(每次6只):將大鼠重新麻醉后固定在定位儀上,坐標值同前;用頭皮針連接微量注射器抽取尿激酶 10 μL[6,7],沿鉆孔處進針深約 6.3 mm,5 min內(nèi)注入尿激酶;待約45 min后用1 mL注射器代替微量注射器連接真空管外端,利用負壓輕柔緩慢抽吸血腫,抽吸量為總量的30% ~40%;緩慢退針,常規(guī)創(chuàng)口消毒后縫合皮膚。

        1.2.2 大鼠腦出血灶周組織中IL-6、TNF-α 的檢測手術(shù)組于術(shù)后4 h、造模組和對照組均于造模后6、12、24、48、72 h 各斷頭處死 6 只大鼠,取血腫靠近皮層側(cè)(尾狀核平面)腦組織約2 mm3,用4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片厚度約4 μm。采用免疫組化SP法染色,按試劑盒說明書操作,陽性細胞為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。每組隨機選取5個不重疊視野,在400倍顯微鏡下進行觀察,計數(shù)陽性細胞數(shù),取平均值。

        1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。所得數(shù)據(jù)以表示,組間比較用t檢驗,多組、多時點的比較采用Post-hoc方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        不同時點各組大鼠腦出血灶周組織中TNF-α、IL-6陽性細胞數(shù)比較,見表1。

        表1 不同時點各組大鼠腦出血灶周組織中TNF-α、IL-6 陽性細胞數(shù)比較(個/HP,)

        表1 不同時點各組大鼠腦出血灶周組織中TNF-α、IL-6 陽性細胞數(shù)比較(個/HP,)

        注:與對照組同時點比較,*P<0.05;與模型組同時點比較,#P <0.05;與同組前一時點比較,△P <0.05

        組別 TNF-α陽性細胞 IL-6陽性細胞對照組6 h 2.32 ±0.30 21.05 ±7.6212 h 2.51 ±0.51 27.23 ±11.2024 h 3.25 ±0.43 32.31 ±12.2248 h 2.96 ±0.28 37.52 ±16.2472 h 2.08 ±0.35 42.20 ±11.33模型組6 h 7.31 ±0.34* 47.83 ±16.74*12 h 23.24 ±0.81*△ 66.29 ±18.13*△24 h 28.17 ±0.63*△ 68.26 ±19.22*△48 h 21.26 ±0.55*△ 73.82 ±19.25*△72 h 17.06 ±0.52* 82.31 ±17.42*△手術(shù)組6 h 4.23 ±0.51*# 34.67 ±17.21*#12 h 14.13 ±1.23*#△ 42.72 ±17.33*#△24 h 16.21 ±0.93*#△ 43.53 ±18.24*#△48 h 13.26 ±0.52*#△ 56.42 ±18.22*#△72 h 11.48 ±0.73*# 63.71 ±17.83*#△

        3 討論

        近年來研究[8,9]表明,自發(fā)性高血壓性腦出血后,積血釋放凝血酶、細胞毒性物質(zhì)及其他分解產(chǎn)物,造成炎癥細胞浸潤,導致腦水腫及神經(jīng)細胞凋亡和炎性因子如 IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 等的釋放,引起附近腦組織損害,進一步造成血腦屏障的破壞。TNF-α是一種具有廣泛生物學功能的細胞因子,可通過促進凝血、增加內(nèi)皮細胞通透性及誘導黏附分子或其他炎性介質(zhì)等表達,增加血腦屏障的通透性,加重腦損傷。本研究結(jié)果顯示,模型組和手術(shù)組大鼠腦出血后6 h,腦出血灶周組織中TNF-α表達即增加,24 h達高峰,以后逐漸下降;而手術(shù)組TNF-α表達明顯低于模型組、高于對照組(P均<0.05),且以造模后6 h手術(shù)的大鼠表達最低(P均<0.05)。提示盡早進行微創(chuàng)清除血腫可以減輕血腫周圍組織中TNF-α表達,從而保護神經(jīng)組織。

        在自發(fā)或其他因素的刺激下,淋巴細胞與多種非淋巴細胞都能產(chǎn)生IL-6。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)IL-6主要源于巨噬細胞、有活性的星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞及神經(jīng)內(nèi)皮細胞等。有學者認為,正常神經(jīng)細胞中IL-6保持低表達發(fā)揮中樞介導、神經(jīng)修復等生理作用,但在腦出血后IL-6表達增高,參與神經(jīng)損傷過程。本研究結(jié)果顯示,隨著腦出血時間的延長,模型組和手術(shù)組大鼠腦出血灶周組織中IL-6表達逐漸增加,72 h時最高。說明在腦出血急性期IL-6表達處于高水平,介導了腦出血后的腦組織損傷。

        微創(chuàng)穿刺治療操作簡便,可以早期清除血腫,降低顱內(nèi)壓,挽救患者生命,有利于腦功能康復,具有創(chuàng)傷小、費用少、術(shù)后康復快、技術(shù)易掌握等優(yōu)點[10],但對于微創(chuàng)治療最佳時機的選擇尚無定論。本研究分別在大鼠腦出血后6、12、24、48、72 h行血腫穿刺清除術(shù),觀察不同時機手術(shù)對腦組織中TNF-α、IL-6表達的影響。結(jié)果顯示,觀察組6 h手術(shù)大鼠血腫周圍腦組織中TNF-α、IL-6的表達明顯低于其他時間手術(shù)大鼠。說明在腦出血早期即有腦內(nèi)的炎癥因子激活,超早期(出血后6 h)進行血腫清除可解除血腫壓迫引起的腦損傷,還能降低血液分解產(chǎn)物的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果還顯示,腦出血后腦組織中IL-6表達高峰較TNF-α表達高峰出現(xiàn)的晚,可能與TNF-α激活了小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞分泌IL-6有關(guān)。

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