蔣翡翎，單保恩，姚 敏，魏小斌，伍 燕，鄧碧蘭

(1.?？谑腥嗣襻t(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?5702082.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北 石家莊 050011)

我們前面已有實(shí)驗(yàn)證明活卡介苗(BCG)的有效組分BCGE2和BCGE3在體外可以誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及產(chǎn)生細(xì)胞因子[1]，并且BCGE2和BCGE3還可以誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO[2]，因此BCGE2和BCGE3可以作為免疫調(diào)節(jié)劑來(lái)誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。那么這些經(jīng)誘導(dǎo)激活的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞是否具有殺傷或抑制作用呢？本研究旨在將人膀胱癌細(xì)胞株T24作為靶細(xì)胞對(duì)BCGE2的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡的昆明小鼠、體重18～22 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 BCG購(gòu)于北京生物制品研究所，胎牛血清為杭州四季青生物工程材料公司生產(chǎn)，Sephadex G100凝膠層析柱購(gòu)自Sigma公司，RPMI1640為GIBCO公司產(chǎn)品，Gress試劑購(gòu)自華美生物公司，腫瘤細(xì)胞株T24由河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院科研中心提供。

1.3 BCG蛋白提取液的制備及蛋白含量測(cè)定 用酶裂解法和超聲波破碎法對(duì)活BCG進(jìn)行裂解，用紫外吸收法測(cè)定其上清液中蛋白質(zhì)(BCGE)的純度；用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白含量。

1.4 BCGE蛋白活性組分的分離 將BCGE上樣于Sephadex G100凝膠層析柱，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫，每管收集2 ml層析液，分離后得到3個(gè)組分，分別命名為 BCGE1、BCGE2和 BCGE3，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為42500 D、36300 D和28600 D。

1.5 腫瘤細(xì)胞株懸液制備 腫瘤細(xì)胞株T24細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃，飽和濕度，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后收集細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整成濃度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液備用。

1.6 脾效應(yīng)細(xì)胞懸液制備 無(wú)菌取小鼠脾臟，在200目鋼篩上研磨，制備成單個(gè)細(xì)胞懸液，離心，棄上清，裂解紅細(xì)胞后用Hank's液洗兩次，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3.5×106個(gè)/ml。然后接種于24孔板，加入RPMI1640配制的BCGE2并調(diào)節(jié)使其終濃度為600μg/ml，作用48 h后收集細(xì)胞(對(duì)照組加RPMI1640培養(yǎng)液)，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)算存活率為90%，后用D-Hank's液洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。

1.7 淋巴細(xì)胞殺傷功能測(cè)定 參照改良四甲基偶氮唑鹽比色法MTT法[3]，實(shí)驗(yàn)孔加待測(cè)的經(jīng)BCGE2作用后的小鼠脾效應(yīng)細(xì)胞懸液與T24細(xì)胞懸液各100 μl，調(diào)節(jié)效靶比為5:1、10:1、20:1(陰性對(duì)照組加入未經(jīng)BCGE2作用的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液與T24細(xì)胞懸液，各100 μl，并調(diào)節(jié)效靶比為5:1、10:1、20:1)，另設(shè)單純淋巴細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)及T24細(xì)胞(靶細(xì)胞)對(duì)照，均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，加入MTT 100μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加入15%十二烷基磺酸鈉(SDS)100μl，過(guò)夜。次日用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm，參考波長(zhǎng)為630 nm。計(jì)算淋巴細(xì)胞的殺傷活性。其計(jì)算公式為：淋巴細(xì)胞活性(%)=[靶細(xì)胞對(duì)照組OD值-(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞OD值)]/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值×100%。

2 結(jié)果

鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組的膀胱癌細(xì)胞布滿整個(gè)視野，加入效靶比為20:1的實(shí)驗(yàn)組，膀胱癌細(xì)胞顯著減少，見(jiàn)圖1。BCGE2體外可誘導(dǎo)和促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)T24的殺傷作用。由表1結(jié)果可見(jiàn)，未經(jīng)BCGE2誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱癌細(xì)胞株僅具有較輕微的殺傷作用，在效靶比為20:1時(shí)其抑制率才達(dá)到13.32%。而經(jīng)BCGE2誘導(dǎo)后的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱癌細(xì)胞株T24的殺傷作用顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，在效靶比為10:1時(shí)其抑制率為31.49%，當(dāng)效靶比為20:1時(shí)其抑制率可高達(dá)42.31%。

圖1 膀胱癌T 24細(xì)胞的鏡下形態(tài)(×200)

表1 BCGE2體外誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱癌T 24細(xì)胞的殺傷作用

3 討 論

卡介苗是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它可通過(guò)調(diào)節(jié)外周血CD4+/CD8+比例及自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)活性來(lái)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步維持和提高機(jī)體的免疫功能[4]。而NK細(xì)胞主要發(fā)揮非特異性殺傷活性，無(wú)需抗原預(yù)先致敏即能自發(fā)殺傷靶細(xì)胞且不受主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制，因此NK細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤的第一道防線。NK細(xì)胞釋放的殺傷介質(zhì)穿孔素、NK細(xì)胞毒因子等可使靶細(xì)胞溶解破裂。NK細(xì)胞還可通過(guò)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)效應(yīng)，殺傷被特異性抗體包被的瘤細(xì)胞，其機(jī)理為通過(guò)IgG1和IgG2抗體作橋梁，其Fab端特異性識(shí)別腫瘤，F(xiàn)c段與NK細(xì)胞FcRgⅢa結(jié)合，產(chǎn)生抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。NK細(xì)胞也可以將顆粒酶經(jīng)穿孔素在靶細(xì)胞上形成的“孔洞”注入靶細(xì)胞從而使靶細(xì)胞DNA斷裂而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5]，因此NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中起重要作用。而腫瘤患者中的NK細(xì)胞的百分率往往是降低的，預(yù)示機(jī)體NK細(xì)胞作用受抑制,不能有效發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[6]。有研究表明BCG可以直接通過(guò)TLRs激活NK細(xì)胞[7]，使其直接對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。NK細(xì)胞通過(guò)識(shí)別腫瘤抗原與靶細(xì)胞結(jié)合，結(jié)合后微管插入細(xì)胞膜，釋放NK細(xì)胞溶瘤因子(NKCF)，NK細(xì)胞還可通過(guò)多次接觸多個(gè)腫瘤細(xì)胞放大殺傷效應(yīng)[8-9]。本研究結(jié)果也證實(shí)，經(jīng)BCGE2體外誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞株T24的殺傷活性顯著增強(qiáng)(由于未預(yù)先采用抗原致敏，其活性細(xì)胞大多數(shù)為NK細(xì)胞)。未經(jīng)BCGE2誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱癌細(xì)胞株僅具有較輕微的殺傷作用，在效靶比為20:1時(shí)其抑制率才達(dá)到13.32%。而經(jīng)BCGE2誘導(dǎo)后的小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)膀胱癌細(xì)胞株T24的殺傷作用顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，并隨著效靶比的增加而更為顯著，提示BCGE2具有間接的抗腫瘤作用。

[1]蔣翡翎,單保恩,張淑芳,等.卡介苗提取物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(11):827-829.

[2]蔣翡翎,單保恩,姚 敏,等.卡介苗蛋白提取物體外對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,45(4):621-623.

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