丁毅鵬，何海武，石慧芳，林 莉，陳 山，姚紅霞

（1.海南省人民醫(yī)院急救中心，海南 海口 570311；2.海南省農(nóng)墾總醫(yī)院，海南 ?？?570311）

哮喘是一種慢性支氣管炎疾病，現(xiàn)全世界大約有1億多人患病[1-2]。哮喘是由基因、環(huán)境因素等共同作用下導(dǎo)致的疾病。近年來研究表明，17號(hào)染色體基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與多個(gè)民族的哮喘易感性相關(guān)，可能是另一個(gè)與哮喘基因可能為一個(gè)新的哮喘相關(guān)基因[3]。本研究選擇了該基因上兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs7216389和rs11650680，分析海南黎族人群哮喘基與ORMDL基因多態(tài)性間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 120例哮喘患者均為海南黎族，年齡18～72歲，平均（53.6±6.9）歲；男性62例，女性58例。2005-2007年海南黎族支氣管哮喘現(xiàn)況研究中確診及在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院住院或門診的哮喘患者，均符合1997年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。對(duì)照組150例均為健康黎族成人，經(jīng)胸部X線檢查、肺功能測定排除有肺部等呼吸系統(tǒng)疾病，排除心、腦及內(nèi)分泌等疾病，最近2個(gè)月無感染史，1周內(nèi)無使用過任何藥物。年齡20～73歲，平均（50.3±5.9）歲，男性79例，女性71例。哮喘組與對(duì)照組兩組間年齡、性別及居住環(huán)境比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 模板DNA的制備及PCR方法 基因組DNA從研究對(duì)象空腹靜脈血中用酚氯仿提取，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的DNA。ORM2DL3基因rs7216389上游引物為：5'-GGTGGGGTGGCTCACGCCTG2TAATC-3'；下 游 引 物 5'-TTGTCTTT GGAAATCCAGC2CCTGCC-3'；rs11650680 上 游 引物為：5'-TTACCGGGTTTACGGTTGG A-3'；下游引物為：5'-TCCAACCGTAAACCCGGTAA-3'[5]。PCR總反應(yīng)體積為50 μl；無菌去離子水30 μl，10×反應(yīng)緩沖液5 μl，MgCl2溶液(215 mmol/L)3 μl，4×dN TP 混合物4 μl，上、下游引物各4 μl，Taq 酶2 μl，模板DNA 2 μl。PCR 循環(huán)條件：95℃預(yù)變性60 s，95℃變性50 s，58℃退火50 s，72℃延伸75 s，循環(huán)30次；72℃后延伸10 min。

1.2.2 限制性內(nèi)切酶酶切及基因型的鑒定 反應(yīng)總體積25 μl，無菌去離子水10 μl，Buffer G反應(yīng)緩沖液5 μl，BSA(10g/L)(Promega 公司)2 μl，限制性內(nèi)切酶NspⅠ10 IU，37℃水浴14 h過夜。個(gè)體DNA樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.3 rs7216389和rs11650680位點(diǎn)基因型相關(guān)性分析 按照基因型的不同對(duì)rs7216389所有研究對(duì)象分為TT基因型、TC基因型和CC基因型和rs11650680所有研究對(duì)象分為CC基因型、CT基因型和TT基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，樣本數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，率間的比較采用χ2檢驗(yàn)方法進(jìn)行，相關(guān)性分析采用Spearman分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物結(jié)果判定 從圖1可見，ORMDL3基因rs7216389位點(diǎn)CC型PCR反應(yīng)產(chǎn)物片段長度約為520 bp，TT型約為320 bp和 280 bp，TC 型 為 520 bp、320 bp和 280 bp；ORMDL3基因rs11650680位點(diǎn)CC型PCR反應(yīng)產(chǎn)物片段長度約為600 bp，TT型約為250 bp和180 bp，TC型為600 bp、250 bp和180 bp。

圖1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物結(jié)果

2.2 ORMDL3基因rs7216389位點(diǎn)基因型分布 從表1可見，rs7216389位點(diǎn)基因型在哮喘組與對(duì)照組分布有差異，其中以TT型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)spearman分析，TT基因型與哮喘呈正相關(guān)（r=0.775，P＜0.05）。

表1 rs7216389位點(diǎn)基因型分布[例（%）]

2.3 ORMDL3基因rs11650680位點(diǎn)基因型分布 從表2可見，rs11650680位點(diǎn)基因型在哮喘組與對(duì)照組分布有差異，其中以TT型和CC型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)spearman分析，TT和CC基因型與哮喘呈正相關(guān)（r分別為0.674和0.853，P均＜0.05）。

表2 RMDL3基因rs11650680位點(diǎn)基因型分布[例（%）]

3 討論

ORMDL基因是2002年在科學(xué)家對(duì)色素性視網(wǎng)膜炎進(jìn)行基因測序時(shí)發(fā)現(xiàn)的，屬于一種全稱為ORM1-like gene family的新基因家族。該家族可在酵母、脊椎動(dòng)物等中表達(dá)，而在人類中，其由3個(gè)成員基因(ORMDL1、ORMDL2和ORMDL3)組成。ORMDL基因家族非常保守，人類ORMDL同系物可以使酵母突變體恢復(fù)功能[4]。ORMDL基因，尤其是ORMDL3基因已被多項(xiàng)研究證明其與哮喘相關(guān)性強(qiáng)[6-7]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，ORMDL3基因SNP在不同人種中表達(dá)可能存在一定差異。有研究發(fā)現(xiàn)，ORMDL3基因中的SNP rs7216389與蘇格蘭青少年哮喘易感性及病情惡化相關(guān)[8]；而在Galanter等[9]的研究中，不同人種ORMDL3基因中的SNPs(rs4378650、rs12603332)與哮喘易感性相關(guān)。

根據(jù)以上研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)立足于研究海南黎族居民中ORMDL3基因SNP表達(dá)情況。研究結(jié)果顯示：黎族哮喘患者ORMDL3基因中rs7216389（TT型）和rs11650680（TT和CC）表達(dá)均與正常對(duì)照組有顯著性差異。這結(jié)果與Leung等[10]以中國南方兒童為研究對(duì)象的結(jié)果相符，該結(jié)果表明，rs7216389和rs11650680可能與海南黎族居民哮喘相關(guān)，但其確切聯(lián)系尚待進(jìn)一步多中心研究加以證實(shí)。

[1]金 哲,王金鳳,吳奎武，等.哮喘相關(guān)基因ORMDL3研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)研究雜志[J].2010,39(7)：113-115.

[2]Beasley R.The burden of asthma with specific reference to the United States[J].JAllergy ClinImmunol.2002,109(5)：S482-489.

[3]Ober C,Hoffjan S.Asthma genetics 2006：the long and winding road to gene discovery[J].Genes Immun,2006，7：95-100.

[4]Lars H,Miquel T,Gemma M,et al.ORMDL proteins are a conserved new family of endoplasmic reticulum membrane proteins.Genome Biology[J].2002,3(6)：1-16.

[5]孫 婧,李喬俊,徐 飛,等.兒童哮喘與ORMDL3基因多態(tài)性關(guān)系的研究[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐[J].2010,16(4)：361-363.

[6]Moffatt MF,Kabesch M,Liang L,et al.Genetic variants regulating ORMDL3 expression con tribute to the risk of childhood asthma.Nature[J].2007,448(7152)：470-473.

[7]Collins FS,Guyer MS,Charkravarti A.Variations on asthma：Cataloging human DNA sequence variation.Science[J].1997,278(5343)：1580-1581.

[8]Tavendale R,Macgregor DF,Mukhopadhyay S,et al.A polymorphism controlling ORMDL3 expression is associated with asthma that is poorly controlled by current medications[J].J Allergy Clin Immuno.2008,121(4)：860-863.

[9]Galanter J,Choudhry S,Eng C,et al.ORMDL3 gene is associated with asthma in three thnically diverse populations.Am J Respir Crit Care Med.2008,177(11)：1194-1200.

[10]Leung TF,Hy SY,Ng MC,et al.Asthma and atopy are associated with chromosome 17q21 markers in Chinese children[J].Allergy,2009,64(4)：621-628.