馮婉婷，車曉玲，李進，宗明珠，史玉葉，曹維克，何敬東

(1.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京 210029;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，江蘇淮安 223300)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道最常見惡性腫瘤之一，占所有惡性腫瘤的10% ～15%［1］。伊立替康(CPT-11)作為拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑家族成員之一，可抑制DNA單鏈斷裂后修復(fù)，干擾DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡［2］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性CRC的治療［3］，無論是用于一線治療，還是在氟尿嘧啶治療失敗后的二線治療，CPT-11均顯示了其抗腫瘤的活性。然而化療藥物引起的耐藥是制約其療效的重要因素之一，因此，不斷提高患者化療敏感性是臨床化療亟需解決的重要課題。目前，有關(guān)預(yù)測CPT-11耐藥性的相關(guān)分子標(biāo)志物的研究相對較少，主要集中在藥物代謝過程中參與的酶、轉(zhuǎn)運蛋白以及作用靶點蛋白的基因。人結(jié)腸癌耐藥細胞株的建立可為研究腫瘤耐藥機制、逆轉(zhuǎn)CRC耐藥提供實驗基礎(chǔ)。因此，本研究將采用逐步提高培養(yǎng)基中CPT-11濃度的方法，間歇誘導(dǎo)CRC細胞耐藥，并對親本細胞與耐藥細胞進行比較，初步探討其生物學(xué)特性及其耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人源性結(jié)直腸癌細胞株HT-29購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

1.1.2 試劑與載體 CPT-11(Sigma公司)，細胞周期檢測試劑盒(Beckman公司)，RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄及擴增試劑盒(Biouniquer公司)，CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及耐藥細胞的建立 將人結(jié)直腸癌細胞株HT-29置于含有10%胎牛血清、100 U·ml－1青霉素和100 μg·ml－1鏈霉素的 1640 培養(yǎng)基，置 37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。采用逐步提高培養(yǎng)基中CPT-11濃度的方法，間歇誘導(dǎo)腫瘤細胞耐藥。CPT-11濃度從4 μg·ml－1開始，加藥 48 h 后換液撤藥，3 ～4 d 換液1次，待細胞重新長至對數(shù)生長期時再次加相同濃度藥物進行誘導(dǎo)，如此重復(fù)再增加藥物濃度，連續(xù)培養(yǎng)10 個月，獲得能在 60 μg·ml－1濃度中穩(wěn)定生長的人結(jié)直腸癌耐藥細胞株，并命名為HT-29/CPT-11。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞藥敏性 取對數(shù)生長期的親本細胞HT-29和耐藥細胞HT-29/CPT-11，胰酶消化后，按每孔100 μl含2×104個細胞接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h后分別加入藥物濃度分別為20、40、80、160、240、320 μg·ml－1的 CPT-11，設(shè)置 6 個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用全自動酶標(biāo)儀在450 nm處測定OD值。計算藥物CPT-11分別對HT-29、HT-29/CPT-11的半數(shù)抑制率(IC50)。

細胞抑制率(%)=(1－實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=子代細胞IC50/親代細胞IC50。

IC50采用改良寇氏法計算:Ig(IC50)=Xm－I(P－(3－Pm－Pn)/4)(Xm:Ig最大劑量，I:Ig最大劑量/相臨劑量，P:陽性反應(yīng)率之和，Pm:最大陽性反應(yīng)率，Pn:最小陽性反應(yīng)率)

1.2.3 測定細胞生長曲線及倍增時間 將對數(shù)生長期的HT-29和HT-29/CPT-11細胞，以濃度為2×104ml－1分別接種在96孔板，間隔24 h分別取3個復(fù)孔，計數(shù)每孔活細胞數(shù)量，連續(xù)計數(shù)8 d，按每天計數(shù)細胞數(shù)量繪制細胞生長曲線。計算細胞的倍增時間公式:TD=t×log 2/(logNt－logNo)(其中TD:群體倍增時間，t:培養(yǎng)時間，N0、Nt分別代表接種后及培養(yǎng)t小時后的細胞數(shù))。

1.2.4 流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞周期 收集處于對數(shù)生長期的HT-29和HT-29/CPT-11細胞，每組細胞數(shù)約1 ×106個，以1 500 r·min－1離心 5 min，PBS 洗2遍，預(yù)冷70%乙醇固定，再用PBS洗2遍，棄上清，在細胞沉淀中加入0.1%RNA酶A溶液150 μl重懸細胞，4 ℃ 孵育 30 min，再加入 0.1%PI染液 150 μl混勻，4℃避光孵育10 min，將細胞懸液混勻，用200目尼龍膜濾過到流式管中，加入1 ml PBS用FCM進行細胞周期分析，重復(fù)實驗3次。

1.2.5 RT-PCR半定量測定MDR-1 mRNA的表達分別收集處于對數(shù)生長期的HT-29和HT-29/CPT-11細胞，TRIzol一步法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作(反應(yīng)體系20 μl)，合成第一鏈cDNA，擴增如試劑盒說明(反應(yīng)體系25 μl)。引物序列:MDR-1上游引物5'-TCGTAGGAGTATCCGTGGAT-3'，下游引物5'-CATTGGGCGAGCCTGGTAG-3';內(nèi)參β-actin上游引物 5'-GCCTGGAAGTGAAGTTGTGGACTCCCG-3'，下游引物 5'-CCAGCGTGAGTACTGCTGCGGCTCAG-3'。PCR循環(huán)條件:95℃ 3 min;94 ℃ 30 s，58.3℃ 30 s，72 ℃1 min，36個循環(huán);72℃ 5 min。以β-actin作為內(nèi)參，1%瓊脂糖凝膠100 V等壓電泳觀察實驗結(jié)果，凝膠成像儀掃描，以目的基因與β-actin光密度積分值之比作為其相對表達量(Image J)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)親本細胞株HT-29呈圓形或橢圓形，細胞鑲嵌排列成鋪路石樣且成團生長(圖1)。耐藥細胞株HT-29/CPT-11比親本HT-29細胞體積明顯增大，形態(tài)也發(fā)生變化，排列紊亂無規(guī)律，細胞生長彌散。

圖1 光鏡觀察細胞形態(tài) ×10Fig 1 Light microscopy observation of cell morphology×10

2.2 藥物敏感性試驗

CCK-8檢測結(jié)果顯示，CPT-11對HT-29和HT-29/CPT-11 細胞的 IC50分別為(40.59 ± 3.29)μg·ml－1和(264.43 ± 8.98)μg·ml－1，耐藥指數(shù)為 6.51(圖2)。提示HT-29/CPT-11細胞對CPT-11有明顯的耐藥性(P＜0.05)。

圖2 CPT-11對HT-29或HT-29/CPT-11的IC50Fig 2 IC50of CPT-11 in HT-29 or HT-29/CPT-11 cell lines

2.3 細胞生長曲線和群體倍增時間

細胞生長曲線(圖3)顯示，兩種細胞在6～7 d達到對數(shù)生長期，耐藥細胞株HT-29/CPT-11較HT-29群體倍增時間稍延長，分別為(41.29±1.69)h和(27.12 ±2.73)h，生長增殖速度減慢，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 細胞生長曲線Fig 3 Growth curve of two cell lines

2.4 耐藥細胞株細胞周期的變化

見表1。

表1 HT-29和HT-29/CPT-11細胞周期比較(±s)Tab 1 Comparison of cell cycle between HT-29 and HT-29/CPT-11(±s)

表1 HT-29和HT-29/CPT-11細胞周期比較(±s)Tab 1 Comparison of cell cycle between HT-29 and HT-29/CPT-11(±s)

與 HT-29細胞比，a P ＜0.05

細胞株 G0/G1期 S期 G2/M期HT-2949.8 ±1.83 40.5 ±1.4 9.7 ±1.25 HT-29/CPT-11 60.2 ±2.71a 27.1 ±2.3a 12.7 ±1.8

由表1可見，與親本細胞相比，HT-29/CPT-11耐藥細胞的細胞周期分布發(fā)生明顯改變，G0/G1期細胞增加，S期細胞減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 RT-PCR檢測MDR-1 mRNA表達

見圖4。

圖4 HT-29和HT-29/CPT-11細胞MDR-1 mRNA的表達Fig 4 The expression level of MDR-1 mRNA in HT-29 and HT-29/CPT-11 cell lines

Image J圖像分析結(jié)果顯示，HT-29/CPT-11、HT-29兩株細胞MDR-1/β-actin的光密度積分值之比分別為1.086 ±0.054 和 0.416 ±0.02(P＜0.05)，HT-29/CPT-11耐藥細胞MDR-1表達明顯高于親本細胞株HT-29，說明在CPT-11的長期刺激下可以誘導(dǎo)耐藥細胞MDR-1基因表達增強。

3 討 論

細胞耐藥既是正常細胞維持自身穩(wěn)定的防御機制之一，也是引起腫瘤化療失敗及腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因之一。腫瘤細胞耐藥機制十分復(fù)雜，迄今為止，體外誘導(dǎo)耐藥細胞株仍是研究細胞分子生物學(xué)變化及腫瘤耐藥機制的基礎(chǔ)。

近年來，國內(nèi)外相繼建立了胃癌、乳腺癌、卵巢癌等耐藥細胞模型。我們采用逐步提高培養(yǎng)基中CPT-11濃度的方法，間歇誘導(dǎo)CRC耐藥細胞株，歷經(jīng)10月余，成功建立并鑒定了人結(jié)直腸癌CPT-11耐藥細胞株HT-29/CPT-11。其對 CPT-11耐藥指數(shù)為6.51。且耐藥細胞株HT-29/CPT-11細胞形態(tài)異型性明顯增加。除此之外，細胞倍增時間顯著延長。目前認(rèn)為，腫瘤細胞倍增時間越短，對化療藥物越敏感，療效越好;反之，對化療藥物的敏感性降低。流式結(jié)果顯示G0/G1期細胞增加，S期細胞減少，說明細胞在耐藥之后其增殖受到明顯抑制，DNA復(fù)制時間延長。

腫瘤的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)機制是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，影響因素和參與機制眾多。目前，關(guān)于腫瘤耐藥機制的研究主要集中以下幾點:(1)轉(zhuǎn)運蛋白引起的耐藥，包括有腫瘤MDR基因［4］編碼產(chǎn)物的P-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)的高表達、MDR相關(guān)蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)基因及其產(chǎn)物的表達［5］。(2)GSH 依賴性解毒酶系統(tǒng)的改變［6］，谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶(ghtathione S-transferase，GST)參與化療藥物的解毒，降低抗腫瘤藥物的細胞毒作用，從而產(chǎn)生耐藥。(3)當(dāng)DNA損傷修復(fù)時，參與修復(fù)的相關(guān)酶，包括核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶等數(shù)種酶活性增強。細胞修復(fù)損傷的能力和MDR產(chǎn)生密切相關(guān)［7］。(4)細胞外低pH值、細胞質(zhì)內(nèi)高pH值的特點，不僅可造成化學(xué)治療藥物被隔離在酸性區(qū)內(nèi)，還能上調(diào)P-gp表達和活性，結(jié)果使化學(xué)治療藥物無法到達細胞內(nèi)靶點發(fā)揮作用，導(dǎo)致腫瘤對化療藥物耐藥［8］。

細胞內(nèi)藥物蓄積減少是最先發(fā)現(xiàn)的、也是最常見的導(dǎo)致腫瘤耐藥的原因之一。有研究［5-9］顯示，參與藥酶代謝的ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族可以減少細胞之間藥物的蓄積，從而使得細胞對喜樹堿類藥物耐藥。膜轉(zhuǎn)運蛋白中P-gp、MRP2和BCRP是參與CPT-11代謝最重要的轉(zhuǎn)運蛋白。耐藥細胞表面P-gp的發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識到藥物泵對藥物的主動外排是細胞內(nèi)藥物蓄積減少的主要原因［5］。MDR-1基因的過度表達是產(chǎn)生多藥耐藥的主要機制，這一觀點已得到公認(rèn)［4］。MDR-1基因編碼跨膜糖蛋白P-gp，P-gp具有“藥泵功能”，是一種ATP依賴性藥泵，通過分解ATP提供能量，將藥物轉(zhuǎn)運到細胞外，使細胞內(nèi)藥物濃度維持較低水平，從而產(chǎn)生耐藥。腫瘤細胞在長期的化療藥物的刺激下，耐藥基因及其編碼蛋白表達的改變可以進一步證實細胞株的耐藥性。因此，本實驗將MDR-1基因作為研究對象，采用RT-PCR技術(shù)檢測耐藥細胞株耐藥細胞株HT-29/CPT-11和親本細胞株HT-29中MDR-1基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株MDR-1基因表達明顯增加(1.086 ±0.054vs0.416 ±0.02，P＜0.05)，這說明在CPT-11的長期刺激下可以誘導(dǎo)耐藥細胞MDR-1基因表達增強，提示MDR-1基因的高表達可能是造成HT-29/CPT-11細胞內(nèi)CPT-11藥物蓄積減少，從而成為耐藥發(fā)生的可能機制之一。當(dāng)然除了細胞MDR-1基因參與之外，還有其他途徑參與，有待進一步研究。

總之，本研究結(jié)果表明，我們利用藥物濃度遞增間歇誘導(dǎo)出的人結(jié)直腸癌CPT-11耐藥細胞株在細胞形態(tài)、細胞周期、生長速度上以及藥物敏感性等方面發(fā)生了明顯的變化，符合耐藥細胞的特征。在下一步研究中，我們將利用耐藥細胞株HT-29/CPT-11進行耐藥機制以及耐藥逆轉(zhuǎn)方面的研究。

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