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        烏司他丁對重癥急性胰腺炎患者早期外周血單核細胞Toll樣受體4表達的影響

        2012-09-03 01:49:44衛(wèi)文俊陶霖玉李蓉陳玲王玉蓉曾鳳好
        關(guān)鍵詞:烏司單核細胞外周血

        衛(wèi)文俊,陶霖玉,李蓉,陳玲,王玉蓉,曾鳳好

        (廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院普外科,廣東深圳 518052)

        重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是一類起病急、病情復(fù)雜、治療棘手的臨床常見急腹癥,其病情的演變及加重與繼發(fā)的局部和全身炎癥介質(zhì)的過度釋放、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory syndrome,SRIS)有關(guān)。烏司他丁(ulinastatin)是從人尿液中分離、純化的尿胰蛋白酶抑制劑。動物實驗表明,烏司他丁對急性胰腺炎具有明顯的抗炎治療效果;部分臨床研究也提示其具有控制病情、緩解癥狀的作用。但關(guān)于其作用機制仍未完全明了,并存在爭議[1-2]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)屬于一種病原微生物模式識別受體,作為脂多糖的跨膜受體,是炎癥反應(yīng)的門戶蛋白,在免疫防御反應(yīng)中起著十分重要的作用[3]。烏司他丁對急性胰腺炎引起的全身炎癥反應(yīng)的拮抗及抑制作用是否與抑制單核細胞表面Toll樣受體4的表達有關(guān),目前尚不明確。本研究旨在觀察烏司他丁對重癥急性胰腺炎患者外周血單核細胞Toll樣受體4表達的影響,探討烏司他丁治療重癥急性胰腺炎的作用靶點及抑制炎癥反應(yīng)的作用機制。

        1 資料和方法

        1.1 研究對象

        根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)會急性胰腺炎的臨床診斷及分級標(biāo)準(1996年第2次方案),選擇2008年6月至2011年6月在我院住院的重癥急性胰腺炎患者58例,其中男31例,女27例,年齡28~62歲,平均(38±6)歲,隨機分為烏司他丁組(29例,予以常規(guī)治療+烏司他丁)、常規(guī)組(29例,予以常規(guī)治療)。另外,選擇20例健康志愿者作為對照組,其中男11例,女9例,年齡26~60歲,平均(35±5)歲。3組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        1.2 主要試劑和儀器

        流式細胞儀CYTOMICS FC 500購自Beckman公司,藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗人TLR4單克隆抗體購自eBioscience公司(美國),異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人CD14單克隆抗體購自Beckman Coulter公司,TNF-α、IL-6 檢測試劑盒(Quantikine EL ISA Kit,R &D Systems)購自Minneapolis公司。

        1.3 方法

        1.3.1 治療方法 (1)常規(guī)組:予以禁食、胃腸減壓、抑制胰酶活性、糾正水電解質(zhì)平衡、搶救休克、預(yù)防感染及營養(yǎng)支持等治療。(2)烏司他丁組:在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上,予烏司他丁10萬U溶于5%葡萄糖注射液500 ml,靜脈滴注,每天2次,每次2 h滴完,3 d后改為10萬U,每天1次,療程7~14 d。

        1.3.2 標(biāo)本的采集和處理 用無熱源的EDTA K2抗凝的無菌真空采集管采集SAP患者入院第1天治療前,入院后第3、5、7、14天的靜脈血各 15 ml。對照組僅采血1次。血標(biāo)本均在30 min內(nèi)處理:4℃離心5 min后,提取0.5 ml血漿,置冰箱-70℃凍存用于檢測細胞因子。

        1.3.3 TLR4、CD14檢測 血標(biāo)本于12 h內(nèi)進行直接免疫熒光標(biāo)記單核細胞表面CD 14和TLR 4,以流式細胞儀檢測CD 14和TLR 4表達。方法為100 μl全血 +5 μl TLR4-PE+10 μl CD14-FITC,避 光 孵 育20 min,加入 Optilyse C溶血素(Beckman Coulter公司)500 μl,溶血 10 min,1 500 × g 離心 5 min,加入2 ml PBS混勻,1 500 ×g離心 5 min,加入 500 μl PBS后上機檢測,以CD14圈門,檢測門內(nèi)細胞PE的平均熒光強度,用Mouse IgG2a作為同型對照。

        1.3.4 血漿 TNF-α、IL-6的檢測 以 ELISA試劑盒檢測血漿TNF-α、IL-6水平,操作嚴格按試劑盒說明進行。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

        2 結(jié) 果

        2.1 3 組 TLR4、CD14 的表達

        見表1。

        表1 3組外周血單核細胞表面TLR4的表達變化(±s)Tab 1 The expression of TLR4 on PBMCs among the three groups( ±s)

        表1 3組外周血單核細胞表面TLR4的表達變化(±s)Tab 1 The expression of TLR4 on PBMCs among the three groups( ±s)

        與對照組比較,a P <0.01,b P <0.05;與常規(guī)組比較,c P <0.05

        組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 5.01 ±1.21 - - - -常規(guī)組 29 11.86 ±2.59a 10.25 ±2.24b 8.65 ±2.89b 6.28 ±2.32b 5.10 ±2.74烏司他丁組 29 12.20 ±2.26a 8.02 ±2.45bc 6.21 ±3.21bc 5.05 ±2.36c 4.95 ±2.33

        由表1可見,與對照組比較,在入院第1天常規(guī)組和烏司他丁組患者外周血單核細胞TLR4表達明顯增高(均P<0.01),在入院治療后第3、5天 TLR4表達逐漸降低,但仍高于對照組(均P<0.05)。烏司他丁組在入院后第7天TLR4表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),入院后第14天兩組TLR4表達均基本恢復(fù)正常。烏司他丁組與常規(guī)組在入院第1天治療前,外周血單核細胞TLR4表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而在治療后第 3、5、7 天烏司他丁組外周血單核細胞TLR4的表達均明顯低于常規(guī)組(P<0.05)。CD14的表達在3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

        表2 各組外周血單核細胞CD14的表達變化(±s)Tab 2 The expression of CD14 on PBMCs among the three groups( ±s)

        表2 各組外周血單核細胞CD14的表達變化(±s)Tab 2 The expression of CD14 on PBMCs among the three groups( ±s)

        組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 17.35 ±4.21 - - - -常規(guī)組 29 17.88 ±4.86 17.52 ±3.96 17.42 ±3.94 16.98 ±4.28 17.11 ±4.08烏司他丁組 29 17.69 ±5.20 17.54 ±5.36 17.29 ±4.57 17.19 ±4.12 17.23 ±5.14

        2.2 3 組 TNF-α、IL-6 濃度的檢測

        常規(guī)組和烏司他丁組入院第1天外周血TNF-α、IL-6的濃度均明顯高于對照組(P<0.01),入院治療后第3、5、7天逐漸降低,但仍較對照組增高(P<0.05);烏司他丁組在治療后第3、5、7天,外周血TNF-α、IL-6的濃度與常規(guī)組對應(yīng)時點比較均明顯降低(P<0.05,見表3、4)。

        表3 各組血漿中TNF-α濃度水平(±s)Tab 3 Blood concentration of TNF-α among the three groups( ± s) pg·ml-1

        表3 各組血漿中TNF-α濃度水平(±s)Tab 3 Blood concentration of TNF-α among the three groups( ± s) pg·ml-1

        與對照組比較,a P <0.01,b P <0.05;與常規(guī)組比較,c P <0.05

        組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 12.52 ±2.03 - - - -常規(guī)組 29 32.65 ±5.26a 29.87 ±4.96b 24.64 ±5.94b 20.57 ±4.38b 13.36 ±4.26烏司他丁組 29 33.15 ±6.12a 24.25 ±5.18bc 19.75 ±4.65bc 14.69 ±4.85bc 12.23 ±5.24

        表4 各組血漿中IL-6濃度水平(±s)Tab 4 Blood concentration of IL-6 among the three groups( ± s) pg·ml-1

        表4 各組血漿中IL-6濃度水平(±s)Tab 4 Blood concentration of IL-6 among the three groups( ± s) pg·ml-1

        與對照組比較,a P <0.01,b P <0.05;與常規(guī)組比較,c P <0.05

        組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 17.58 ±4.65 - - - -常規(guī)組 29 32.65 ±5.01a 28.77 ±4.85b 26.64 ±5.88b 21.57 ±4.12b 17.36 ±4.09烏司他丁組 29 31.21 ±6.25a 25.65 ±5.84bc 21.75 ±4.45bc 18.69 ±4.61bc 16.89 ±5.61

        2.3 SAP外周血單核細胞 TLR4的表達與血漿TNF-α、IL-6 濃度的相關(guān)性

        Pearson相關(guān)分析表明,常規(guī)組與烏司他丁組組內(nèi)對應(yīng)各時間點,SAP患者外周血單核細胞TLR4表達水平與血漿TNF-α的濃度變化一致,二者具有正相關(guān)性(r=0.953,P<0.05);血漿 IL-6 濃度的變化在各組內(nèi)對應(yīng)時間點與TLR4表達的變化亦具有正相關(guān)性(r=0.902,P<0.5)。

        3 討 論

        Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是近年來被認識的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)的受體,且被認為是炎癥瀑鏈式反應(yīng)的閘門。TLRs屬于Ⅰ類跨膜受體,其胞外結(jié)構(gòu)域負責(zé)刺激信號識別,而胞內(nèi)則是稱為Toll/IL-1R(TIR)的結(jié)構(gòu)域,與信號的傳導(dǎo)相關(guān)。TLRs廣泛分布于單核巨噬細胞系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞和樹突細胞等[4],其配體包括脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白等。現(xiàn)已在人體和小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)13種TLR,分別命名為 TLR1~TLR13。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是第一個被發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體,作為脂多糖(LPS)受體,介導(dǎo)LPS或內(nèi)毒素引起的胞內(nèi)信號傳遞,其激活將引起一系列下游分子的活化,最后激活通用轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,最終引起以TNF-a等為中心的前炎癥因子激活,導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑鏈式釋放而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[5],因此,它可能作為急性炎癥反應(yīng)損傷的扳機點啟動機體的這種病理過程。有研究[6]表明,TLR4在急性胰腺炎觸發(fā)急性炎癥反應(yīng)的過程中具有重要作用,并與多器官功能障礙和腸源性感染的發(fā)生密切相關(guān)。因此,以TLR4為靶點控制這種瀑鏈式炎癥反應(yīng)的有序性,可能是解決類似臨床問題的新方向[7]。

        烏司他丁(ulinastatin)為一種糖蛋白,含有143個氨基酸,分子量約67 kD,是一種典型的Kuniz型的蛋白酶抑制劑,具有兩個活性功能區(qū),兩個活性功能區(qū)均有很廣的抑酶譜,能夠同時抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶等多種水解酶的活性,同時烏司他丁不但對中性粒細胞蛋白酶具有較強的抑制作用,而且還能抑制白細胞釋放炎性介質(zhì),其機制可能是通過阻斷蛋白酶所介導(dǎo)的中性細胞聚集,從而減輕了炎性介質(zhì)與氧自由基的釋放,有效制約了酶、細胞因子、氧自由基級聯(lián)反應(yīng)所形成的炎癥放大效應(yīng)[8]。烏司他丁用于重癥急性胰腺炎的治療,可改善臨床癥狀、提高治療效果,但其作用是否與抑制TLR4有關(guān)尚不明了。

        本研究結(jié)果顯示,與對照組相比較,重癥急性胰腺炎早期,外周血單核細胞TLR4表達明顯增高,隨后逐漸下降,至7 d左右恢復(fù)正常;血中TNF-α、IL-6濃度與TLR4變化一致。表明SAP早期可能通過先天性免疫門戶蛋白TLR4激活單核巨噬細胞系統(tǒng)NF-κB等下游信號因子,導(dǎo)致TNF-α等促炎細胞因子的產(chǎn)生和釋放。烏司他丁組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上,在發(fā)病早期即應(yīng)用烏司他丁治療,結(jié)果在治療后第3天始,外周血單核細胞TLR4的表達均比相應(yīng)常規(guī)組明顯降低,在各對應(yīng)時點TNF-α、IL-6濃度下降的更快,并且恢復(fù)時間也明顯縮短,由此推測,烏司他丁可能對外周血單核細胞表面TLR4的表達有抑制作用,其對重癥急性胰腺炎引起的全身炎癥反應(yīng)的拮抗作用可能與其對TLR4表達的抑制進而減少TNF-α、IL-6等炎癥因子有關(guān)。

        綜上所述,重癥急性胰腺炎早期引起的全身炎癥反應(yīng)與外周血單核細胞表面TLR4的表達異常有關(guān),烏司他丁可能通過影響TLR4的表達起到抑制炎癥反應(yīng)進而改善預(yù)后的作用,但其與TLR4具體的作用機制和相互關(guān)系仍需進一步研究。

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