何海燕

(河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州546300)

甘蔗糖蜜發(fā)酵產(chǎn)黃原膠優(yōu)良菌株的選育

何海燕

(河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州546300)

黃原膠是由野油菜黃單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)的重要的商業(yè)微生物多糖產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)通過微波誘變處理保藏菌株，篩選到一株能以甘蔗糖蜜為碳源發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的優(yōu)良正突變株X12，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在初步確定的實(shí)驗(yàn)條件下，該菌株發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的產(chǎn)量達(dá)22.14 g/L，是未誘變菌株20183的1.53倍，傳代實(shí)驗(yàn)表明，突變菌株X12的黃原膠產(chǎn)量及性狀無大變化，遺傳性狀穩(wěn)定。

甘蔗糖蜜;黃原膠;微波誘變

黃原膠又稱為漢生膠，是一種用途廣泛的微生物胞外多糖。它無味、無臭、無毒、食用安全，是目前國(guó)際上集增稠、懸浮、乳化、穩(wěn)定于一體，性能最優(yōu)越的生物膠［1］，在石油工業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥、化工等諸多行業(yè)獲得了廣泛的應(yīng)用［2］。目前，國(guó)內(nèi)黃原膠發(fā)酵水平與國(guó)外先進(jìn)水平相比尚有較大差距［3］，利用何種有效的途徑提高黃原膠的產(chǎn)量與多糖的品質(zhì)，節(jié)約生產(chǎn)成本，成為近年來黃原膠研究的主要方向［4］。

甘蔗糖蜜是糖廠的主要副產(chǎn)品，成分非常復(fù)雜并且其含糖量仍非常高，蔗糖和還原糖占30%～50%，是發(fā)酵、食品、飼料和建材工業(yè)中質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的原料［5］，中國(guó)是甘蔗種植大國(guó)，甘蔗糖蜜原料非常充足，用糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠，可降低成本，節(jié)約能源，具有一定的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益，實(shí)驗(yàn)通過微波對(duì)黃原膠生產(chǎn)菌進(jìn)行誘變育種，以期得到能利用甘蔗糖蜜高效發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的優(yōu)良生產(chǎn)菌種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)20183，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.1.2 儀器

YP202N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，SW－CL－2FD潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，GNP－9160BS－Ⅲ隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，CS101－AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(中華人民共和國(guó)重慶試驗(yàn)設(shè)備制造)，K021B－BF美的微波爐(廣東美的微波爐制造有限公司)，TXQ－LS－SⅡ全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，糖用錘度計(jì)(浙江余桃儀表二廠)。

1.1.3 培養(yǎng)基

糖蜜由廣西宜州石別糖廠提供，使用前按文獻(xiàn)［6］處理得糖蜜酸化水解液備用;其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

菌種活化培養(yǎng)基:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0。

菌種培養(yǎng)液:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L，pH值為7.0。

平板培養(yǎng)基:蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，8°Bx糖蜜水解液1 L，pH值為7.0。

種子培養(yǎng)液:蛋白胨8 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，8°Bx糖蜜酸化水解液1 L，pH值為7.0。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸1 g，10°Bx糖蜜酸化水解液1 L，pH值為7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將保藏菌種轉(zhuǎn)接至活化培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)36 h，使菌種活化，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 微波誘變實(shí)驗(yàn)

(1)活化菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。

取斜面活化菌株一環(huán)至菌種培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，從6 h后開始，每隔3 h取樣600 nm測(cè)其吸光度(A)值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度(A)值為縱坐標(biāo)繪菌株生長(zhǎng)曲線，根據(jù)生長(zhǎng)曲線選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)。

(2)微波誘變致死率曲線。

取10 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種接入裝有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，并用玻璃珠振蕩，打散菌落。使用十倍稀釋法稀釋菌懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，選取約108個(gè)孢子/mL孢子菌懸液，分裝5 mL至無菌離心管中，以900 W功率微波爐進(jìn)行輻射處理，每次照射10 s后使平皿冷卻，消除熱效應(yīng)，再進(jìn)行照射，并將照射時(shí)間累計(jì)［7］。按照常規(guī)方法稀釋濃度梯度涂布篩選平板，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算致死率并繪畫致死曲線。

(3)黃原膠菌株誘變突變株篩選。

根據(jù)致死率曲線，以致死率為70%～80%的誘變劑量處理菌株［8］，經(jīng)過輻射后涂布平板，在28℃下培養(yǎng)3 d，從平板上挑取大而圓的菌落接到搖瓶種子培養(yǎng)基內(nèi)，置180 r/min搖床28℃恒溫培養(yǎng)36 h，然后以10%接種量，裝液量200 mL/500 mL三角瓶，28℃恒溫?fù)u床180 r/min培養(yǎng)72 h進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。

(4)遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

將選育出的產(chǎn)膠量最高的菌株接種于活化培養(yǎng)基上傳代，共傳六代，相同條件下發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)黃原膠產(chǎn)膠量，檢測(cè)誘變所得黃原膠菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3 黃原膠提取方法［9］

將95%乙醇和發(fā)酵液按1∶2比例混合，室溫下攪拌20 min，過濾，得到黃原膠沉淀置于烘箱中，60℃烘干至恒重稱量。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)菌株生長(zhǎng)曲線

菌種接種到均勻的液體培養(yǎng)基后，細(xì)菌以二分裂繁殖。經(jīng)過遲緩期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并以最大的速率生長(zhǎng)和分裂，導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量呈對(duì)數(shù)增加，此時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)呈平衡生長(zhǎng)，即細(xì)胞內(nèi)各成分按比例有規(guī)律地增加，所有細(xì)胞組分呈彼此相對(duì)穩(wěn)定速度合成。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌的代謝活性高而穩(wěn)定，細(xì)胞大小比較一致，生活力強(qiáng)，易變異，重復(fù)性較好。由圖1可知，該菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線為9～21 h，24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，所以選擇培養(yǎng)18 h的菌液進(jìn)行誘變處理。

圖1 菌株20183的生長(zhǎng)曲線

2.2 微波誘變實(shí)驗(yàn)

2.2.1 微波誘變致死率曲線

微波誘變是一種新興的物理誘變育種技術(shù)，且設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，易于操作，安全高效。微波輻射會(huì)產(chǎn)生熱效應(yīng)，引起生物迅速升溫并導(dǎo)致各種生物功能產(chǎn)生變化。隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸增大。由圖2可知，當(dāng)輻射時(shí)間為60 s時(shí)，致死率在70%～80%之間。根據(jù)誘變的機(jī)制，菌株的正突變幾率可能性最大，因此選用60 s作為誘變篩選的輻射時(shí)間。

圖2 微波誘變致死率曲線

2.2.2 黃原膠菌株誘變突變株篩選

以單位體積發(fā)酵液黃原膠的產(chǎn)量為篩選指標(biāo)，篩選到1株黃原膠產(chǎn)量有較大提高的正突變株X12，由表1可知，該菌株黃原膠的產(chǎn)量達(dá)到了22.14 g/L，是未誘變菌株的1.53倍。

表1 微波誘變后菌株的黃原膠產(chǎn)量對(duì)比

2.2.3 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)突變菌株X12發(fā)酵產(chǎn)膠的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)將突變菌株連續(xù)傳代6次，每代按初步確定的發(fā)酵條件測(cè)定其黃原膠產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變菌株經(jīng)過微波輻射誘變后，基因發(fā)生了突變，總產(chǎn)量得到提高且產(chǎn)量基本維持在22.14 g/L左右，有較好的遺傳穩(wěn)定性。

表2 突變菌株X12傳代實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

甘蔗糖蜜來源廣，價(jià)格低，是重要的工業(yè)發(fā)酵原料，實(shí)驗(yàn)通過微波誘變處理保藏野油菜黃單胞菌20183，篩選到一株能以甘蔗糖蜜作為發(fā)酵原料生產(chǎn)黃原膠的優(yōu)良正突變株X12，該菌株的黃原膠產(chǎn)量達(dá)22.14 g/L，是未誘變菌株的1.53倍，傳代實(shí)驗(yàn)表明，該菌株遺產(chǎn)性狀穩(wěn)定。

［1］常春，馬曉建，方書起，等.黃原膠補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的試驗(yàn)研究［J］.食品科學(xué)，2005，26(12):261－265.

［2］李衛(wèi)旗，吳雪昌，姚恕.培養(yǎng)基的組成對(duì)黃原膠發(fā)酵產(chǎn)量與質(zhì)量的影響研究［J］.工業(yè)微生物，1996，26(1):17－19.

［3］姚仕義，王金生.黃原膠生產(chǎn)菌株XCCNAU－92的選育［J］.生物技術(shù)，1998，(3):34－37.

［4］楊春玉，王霞，蘇海軍，等.黃原膠生物合成的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代化工，2005，25(2):24－28.

［5］保國(guó)裕.1998甘蔗糖綜合利用及廢液治理技術(shù)動(dòng)態(tài)［J］.廣西蔗糖，1999，14(1):38－44.

［6］張克旭.氨基酸發(fā)酵工藝學(xué)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1992.

［7］周建琴，高榮梅.康樂霉素C產(chǎn)生菌的微波誘變［J］.生物學(xué)雜志，2002，19(14):12－13.

［8］劉冬，張學(xué)仁.發(fā)酵工程［M］.北京:高等教育出版社，2007.

［9］里景偉.黃原膠的生產(chǎn)與應(yīng)用［M］.北京:輕工業(yè)出版社，1995.

［責(zé)任編輯劉景平］

The Selection of High Yield Xanthan Gum Producing Strain by Using Sugar－cane Molasses Fermentation

HE Hai－yan
(Departerment of Chem istry and Life Science，Hechi University，Yizhou，Guangxi546300，China)

Xanthan gum is a commercially important polysaccharide produced by fermentation of Xanthomonas campestris．In this study，preservation of strainswas treated by usingmicrowave irradiation，and then a high yield Xanthan gum producing bacterium X12 that can use sugar－canemolasses as fermentation carbon source was selected．The experimental results show that under the experimental condition of the initial establishment，and that the yield of Xanthan gum is 22．14 g/L，153%higher than the original strain 20183．

sugar－canemolasses;Xanthan gum;microwavemutation

book=0,ebook=67

Q939.97

A

1672－9021(2012)02－0022－04

何海燕(1972－)，女，廣西鐘山人，河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系副教授，主要研究方向:微生物發(fā)酵研究。

2011－12－05