文 / 季昀 龐學(xué)燕 譯

（江蘇揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院）

▲接本刊2012年第8期

圖1 MBPIF的UV色譜圖（240 nm，奶粉蛋白質(zhì)含量> 15%）

3.1.2 HPLC-UV法工作特性

學(xué)者們提出了幾種用HPLC-UV定量測(cè)定三聚氰胺的方法（Ishiwata，Inoue，Yamazaki，et al，1987；Kim，et al，2008；Mu?iz Valencia，et al.，2008）。首先，使用三氯乙酸（TCA）－乙腈溶液沉淀蛋白質(zhì)，接著用強(qiáng)離子交換（SCX-SPE）柱進(jìn)行清洗，然后，洗脫液用C18 RP柱，通過(guò)離子對(duì)HPLC進(jìn)行分離。所選的色譜條件可使三聚氰胺從包含有CM和MBPIF的有機(jī)成分中分離出來(lái)（圖1）。除了用保留時(shí)間確定外，在200 nm到400 nm之間記錄三聚氰胺光譜特性也可用來(lái)確定所選峰的特性。

三聚氰胺紫外光譜的吸收譜帶大約在240 nm處（圖2），這些吸收譜帶是三聚氰胺的標(biāo)志。但是，如果色譜層析進(jìn)行的條件和樣本處理得不夠小心，干擾物質(zhì)可能會(huì)使三聚氰胺的定量出現(xiàn)錯(cuò)誤。尤其是像嬰兒配方奶粉這樣含有復(fù)雜蛋白質(zhì)水解形式的低敏感度樣本用這種方法會(huì)受到干擾，因?yàn)橥ㄟ^(guò)沉淀法或固相萃取沒(méi)有將肽徹底去除，所以會(huì)導(dǎo)致三聚氰胺含量的明顯高估。因此，波長(zhǎng)范圍至少在200～270 nm的紫外光譜的記錄結(jié)果需要與三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的光譜記錄結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。另外，樣本中蛋白質(zhì)的含量對(duì)沉淀效果影響很大，研究發(fā)現(xiàn)，被測(cè)樣本的量的多少必須根據(jù)它的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行調(diào)整。為了確保有效的沉淀和好的分離效果，待測(cè)樣本最佳蛋白含量應(yīng)在0.3～0.4 g。

對(duì)于CM，HPLC-UV方法可以檢測(cè)三聚氰胺從0.05 mg/kg到2.50 mg/kg的動(dòng)態(tài)線性變化，對(duì)于蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于15%的MBPIF，檢測(cè)范圍在0.13 mg/kg到6.25 mg/kg之間，而對(duì)于蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥15%的MBPIF，檢測(cè)范圍在0.25 mg/kg到12.50 mg/kg。CM以0.03 mg/kg（0.09 mg/kg）測(cè)定LOD 和LOQ，而蛋白質(zhì)含量小于15%的MBPIF為0.06 mg/kg（0.18 mg/kg），蛋白質(zhì)含量≥15%的MBPIF為0.12 mg/kg（0.36mg/kg），LOD和LOQ信噪比分別為3和10。本試驗(yàn)對(duì)含3 個(gè)不同濃度水平的三聚氰胺的CM和MBPIF測(cè)定了重復(fù)率和批間精密度和回收率，這些工作特性總結(jié)于表4（見(jiàn)2012年第8期）。

作為半定量測(cè)定CM和MBPIF中三聚氰胺殘留的可靠方法，ELISA和HPLC-UV法都能夠滿(mǎn)足指定的范圍要求（世界衛(wèi)生組織和不同國(guó)家最常見(jiàn)的對(duì)于嬰兒配方食品中的三聚氰胺限制量為1 mg/kg，對(duì)于其它牛奶和以牛奶為原料的食品或其它食品為2.5 mg/kg）。就樣本的快速篩選來(lái)講，分析時(shí)間和相對(duì)簡(jiǎn)單的儀器設(shè)備及數(shù)據(jù)處理是理想的，但是，對(duì)于三嗪殺蟲(chóng)劑環(huán)丙氨嗪等ELISA具有特異性交叉反應(yīng)性的樣本來(lái)說(shuō)，這些分析技術(shù)是受限制的。UV和二極管陣列檢測(cè)（DAD）對(duì)于HPLC分離的樣本具有更低的選擇度，因?yàn)楹芏嘤袡C(jī)物的吸收波長(zhǎng)在200～270 nm之間（Ehling，Tefera& Ho，2007； Patakioutas，et al，2007），因此，推薦二者用于篩選。

圖2 用DISCOVERY C18柱于240 nm下分離的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.4 μg/mL）

圖3 1.5 ng/mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（上）和，-三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（下）GC-MS全掃描色譜圖

3.2 鑒定方法

GC-MS對(duì)被測(cè)物的分離效果較好，因?yàn)槠涫歉鶕?jù)分子量選擇靶分子，并鑒定其特征的。使用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記三聚氰胺內(nèi)標(biāo)和單離子監(jiān)測(cè)模式定量測(cè)定實(shí)現(xiàn)了精確定量。在評(píng)價(jià)方法中，串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MS）提供了高度的分離性，它根據(jù)靶分子的分子量選擇靶分子，通過(guò)使用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)已知的碎片離子量來(lái)鑒定特性。應(yīng)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)的同位素稀釋法表明該方法對(duì)不同樣本基質(zhì)效應(yīng)可以進(jìn)行補(bǔ)償（Smoker，Krynitsky，2008）。前人研究證實(shí)了，在寵物食品（Dobson，et al，2008；Varelis，Jeskelis，2008）和CM以及MBPIF中（Desmarchelier，et al，2009）能夠運(yùn)用穩(wěn)定同位素稀釋LC-MS/MS 技術(shù)定量測(cè)定三聚氰胺和三聚氰酸。

圖4 添加0.025 mg/kg 三聚氰胺的MBPIF樣本萃取SIM色譜圖

3.3 GC-MS法工作特性

按照之前描述的分析程序，包括用乙腈沉淀蛋白質(zhì)，然后用強(qiáng)離子交換固相萃取（SCX-SPE）清洗，再衍生。進(jìn)一步通過(guò)GC-MS分析三甲基硅烷基衍生物，在選擇性離子監(jiān)測(cè)模式（SIM）下進(jìn)行定量，如果需要進(jìn)一步鑒定標(biāo)準(zhǔn)，則需要在全掃描（FS）模式下進(jìn)行。選擇用于定量和鑒定的離子見(jiàn)表1（見(jiàn)2012年第4期）。圖3顯示了三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液及其內(nèi)標(biāo)的全掃描色譜圖和質(zhì)譜。3個(gè)三聚氰胺碎片和2 個(gè)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品碎片的單離子檢測(cè)色譜圖見(jiàn)圖4。這種方法使三聚氰胺能夠明確地被鑒定出來(lái)。由于同位素稀釋法的可靠性，校正和測(cè)試樣本只需相同的內(nèi)標(biāo)物溶液即可。這種方法只受到未標(biāo)記三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的不準(zhǔn)確前處理和被測(cè)部分權(quán)重的精密度不足的影響。

圖3顯示了已萃取的2 種主要的離子和標(biāo)記三聚氰胺的差減質(zhì)譜。3種主要的離子的萃取用于三聚氰胺，2種用于標(biāo)記的三聚氰胺。圖4分別為差減質(zhì)譜圖。

三聚氰胺離子質(zhì)荷比為m/z 171、327和342，而被標(biāo)記的三聚氰胺產(chǎn)生的質(zhì)荷比為m/z 333和m/z 348。以批間精密度（iR）為基礎(chǔ)獲得的6 個(gè)不同的外標(biāo)曲線來(lái)測(cè)試線性度。MBPIF中線性度超過(guò)了三聚氰胺的0～0.500 mg/kg 的范圍。校正曲線為線性模型，殘留物均勻分布，且響應(yīng)系數(shù)穩(wěn)定在考慮的濃度范圍內(nèi)。根據(jù)批間精密度來(lái)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，按照所描述的GC-MS法測(cè)定的LOD （0.025、0.050和0.075 mg/kg 每個(gè)6 個(gè)重復(fù)），根據(jù)2002/657/EC 采用的5%的β型錯(cuò)誤于0.019 mg/kg 進(jìn)行鑒定的批間精密度來(lái)驗(yàn)證數(shù)據(jù)（0.025、0.050和0.075 mg/kg每個(gè)6 個(gè)重復(fù)），根據(jù)2002/657/EC 采用的1%的α型錯(cuò)誤并于0.009 mg/kg 來(lái)鑒定進(jìn)行計(jì)算。對(duì)MBPIF中4 個(gè)不同濃度水平的三聚氰胺測(cè)定了重復(fù)性和批間精密度范圍和回收率。這些工作特性總結(jié)于表4（見(jiàn)2012年第8期）。

（未完待續(xù)）