李軍星，王一成，袁秀芳，徐麗華，曹會敏，申世川，張魯濱

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）是豬Glasser's病的病原體，豬上呼吸道的一種共棲菌，它可以在特定條件下侵入機體從而引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎為特征的全身性疾病。H.parasuis的毒力因子尚不明確，外膜蛋白、莢膜多糖、脂多糖、菌毛、神經(jīng)氨酸酶等被認為與H.parasuis的致病性有關[1]。對H.parasuis血清5型高致病性菌株SH0165的全基因組測序表明，其中存在很多毒力相關基因，如細胞致死性膨脹毒素基因（Cytolethal distending toxin，CDT）、oapA脂蛋白基因等，但這些基因與細菌毒力的關系有待于研究[2]。

CDT是多種革蘭氏陰性致病菌的毒力因子。完整的CDT是由3個不同亞基組成的三聚體，即cdtA、cdtB及cdtC。對其它細菌的CDT的研究表明cdtB亞基是CDT毒素的活性中心，具有Ⅰ型脫氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）活性，可以誘導多種哺乳動物細胞凋亡[3]。目前所發(fā)現(xiàn)的CDT的主要功能是破壞真核細胞的染色體DNA，進而引起細胞凋亡。一方面，它可以抑制上皮細胞增殖，并誘導其凋亡，破壞機體黏膜組織，從而有助于細菌侵入機體；另一方面，它可以抑制宿主免疫細胞的增殖，導致局部的免疫抑制。因此，CDT在細菌與宿主的相互作用中發(fā)揮重要作用。本實驗對H.parasuisCDT 3個亞基進行原核表達，并證明表達產(chǎn)物具有良好的抗原性，為進一步研究其生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料H.parasuisXS090923-1分離株由本實驗室分離鑒定保存；H.parasuis自然感染陽性豬血清分離于浙江省某豬場臨床典型病例。DH5α和Rosetta菌株由本實驗室保存；PCR試劑、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶及pET-28a載體購自TaKaRa公司；二抗SPA-HRP及羊抗兔IgG-HRP購自武漢博士德公司。實驗兔由浙江省農(nóng)科院種兔場提供。

1.2 引物設計 根據(jù)H.parasuis菌株XS090923-1的CDT基因序列，通過分析3個亞基cdtA、cdtB、cdtC的信號肽序列，將編碼3個亞基信號肽部分基因序列及終止密碼子切除后，分別設計針對cdtA、cdtB及cdtC基因的引物，在上下游引物中分別引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點（表1）。

1.3 CDT基因的擴增與克隆 用煮沸法提取菌體基因組DNA[4]，進行PCR擴增。反應條件為：94℃5 Min；94℃ 40 s、60℃ 40 s、72℃ 45 s， 32個循環(huán)；72℃10 Min。PCR產(chǎn)物回收純化后進行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，與pET-28a連接，轉(zhuǎn)化，PCR鑒定后，由上海英駿公司測序。將含有cdtA、cdtB及cdtC基因的重組質(zhì)粒分別命名為pET-cdtAhis、pET-cdtBhis及 pET-cdtChis。

表1 擴增CDT不同亞基的引物Table 1 Primers for amplification of CDT subunits

1.4 重組CDT亞基的western blot分析 提取pET-cdtAhis、pET-cdtBhis及pET-cdtChis重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Rosetta細胞，IPTG誘導，SDS-PAGE檢測CDT亞基的表達。利用Ni-NTA親和層析方法純化目的蛋白。將純化的3個CDT亞基重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干法將其轉(zhuǎn)印至PVDF膜，一抗為1∶50稀釋的自然感染豬血清，二抗為1∶3 000稀釋的SPA-HRP，DAB顯色觀察。

1.5 分泌蛋白CDT亞基的western blot分析 將純化的cdtA、cdtB及cdtC蛋白分別以500μg/只的劑量按常規(guī)方法經(jīng)3次免疫實驗兔，制備抗血清。

將XS090923-1株H.parasuis接種于液體TSB培養(yǎng)基（含1%胎牛血清，0.025%NAD），37℃200 r/min過夜培養(yǎng)。離心去除菌體，在上清中加入終濃度10%三氯醋酸（TCA），-20℃放置15 Min，10 000 r/m in離心15 min，棄上清，室溫靜置5 Min使TCA揮發(fā)，用1m L丙酮重懸沉淀，12 000 r/m in離心10m in，棄上清。用1%菌液體積的PBS溶解沉淀，即為制備的H.parasuis分泌蛋白。按1.4中所述方法進行分泌蛋白的western blot分析，其中以大腸桿菌Rosetta裂解液吸附過的兔抗血清（1∶2 000稀釋）作為一抗，1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP為二抗，以未免疫重組蛋白的兔血清作為陰性對照。

2 結果與討論

2.1 CDT基因的PCR擴增與克隆 經(jīng)信號肽分析表明，cdtA、cdtB及cdtC的信號肽長度分別為19、21及19個氨基酸。以H.parasuis分離株XS090923-1基因組DNA為模板，擴增出不含信號肽的cdtA、cdtB及cdtC基因，分別為621 bp、768 bp和471 bp（圖1），符合預期大小。將3個目的基因分別克隆至pET-28a，測序結果表明插入的目的基因閱讀框正確。

圖1 CDT3個亞基基因的大小Fig.1 Size of gene of three CDT subunits

2.2 重組CDT亞基的抗原性分析 將純化的重組蛋白與H.parasuis自然感染陽性豬血清進行western blot試驗，結果顯示3個蛋白均可以被豬血清識別，表明所表達的重組蛋白cdtA、cdtB和cdtC均具有良好的反應原性（圖2）。將H.parasuis體外培養(yǎng)的分泌蛋白及重組CDT亞基與用重組蛋白制備的兔抗血清進行western blot試驗，結果顯示所制備的陽性血清能夠識別分泌蛋白中的cdtA、cdtB及cdtC亞基，并且分泌蛋白中的cdtA、cdtB及cdtC亞基與相應的切除信號肽的重組CDT亞基分子量相似，表明重組蛋白具有良好的免疫原性（圖2）。

圖2 重組CDT亞基的免疫原性及反應原性鑒定Fig.2 Identification of immunogenicity and reactinogenicity of recombinant CDT subunits

本研究對H.parasuisCDT 3個亞基進行信號肽分析表明，3個亞基均含有約20個氨基酸的信號肽。3個切除信號肽的亞基在大腸桿菌中均得到表達，但cdtA與cdtC亞基的分子量均明顯大于理論值，這可能與表達的融合蛋白His-tag結構有關。唐威華等也證明His-tag確實是造成偏差的主要原因[6]。通過SDS-PAGE電泳顯示的原核表達重組蛋白分子量比理論值高的現(xiàn)象比較常見[6-7]，但并非所有His-Tag融合蛋白表觀分子量都偏大，比如本研究中的重組cdtB蛋白表觀分子量與理論值基本相符，因此還存在其它影響表觀分子量的因素。

純化的重組CDT亞基均可以被自然感染豬陽性血清所識別，表明H.parasuis在豬體內(nèi)定殖或感染的過程中分泌了大量CDT毒素，足以刺激機體產(chǎn)生抗體，因此該毒素也許在其致病過程中發(fā)揮作用。某些致病菌CDT基因僅在其侵入宿主細胞時才啟動表達[8]，為了驗證H.parasuis的CDT毒素是否也是相同的情況，我們將H.parasuis體外培養(yǎng)時的分泌蛋白進行western blot試驗，結果證明H.parasuis在體外培養(yǎng)時也表達CDT毒素。并且分泌蛋白中CDT亞基與大腸桿菌表達的相應重組亞基的分子量相當，表明重組CDT亞基信號肽的分析結果與實際相符。因此，為進一步研究重組蛋白在體外組裝成完整的CDT毒素奠定了良好的基礎。

[1]蔡旭旺.副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2006.

[2]Yue Min,Yang Fan.Complete genome sequence ofHaemophilus parasuisSH0165[J].JBacteriol,2009,191（4）:1359-1360.

[3]Jinadasa R N,Bloom S E,Weiss R S,et al.Cytolethal distending toxin:a conserved bacterial genotoxin that blocks cell cycle progression,leading to apoptosis of a broad range ofmammalian cell lineages[J].M icrobiol,2011,157:1851-1875.

[4]de la Puente Redondo V A,Navas Mendez J,Garcia del Blanco N,et al.Typing ofHaemophilus parasuisstrains by PCR-RFLP analysis of the tbpA gene[J].Vet Microbiol,2003,2511:1-10.

[5]唐威華，張景六.SDS-PAGE法測定His-tag融合蛋白分子量產(chǎn)生偏差的原因[J].植物生理學報，2000，26（1）：64-68.

[6]付媛，盧福莊，石團員，等.日本血吸蟲Sj22.6-LHD-Sj23融合基因的克隆及原核表達[J].中國預防獸醫(yī)學報，2010，32（11）：904-907.

[7]馬波，李洪濤.鴨腸炎病毒gB胞漿區(qū)基因片段的克隆及原核表達[J].中國獸醫(yī)科學，2011，41（06）：607-609.

[8]Haghjoo E,Galan J E.Salmonella typhi encodes a functional cytolethal distending toxin that is delivered into host cells by a bacterial-internalization pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:4614-4619.