王 群，鄭小龍，朱來華，肖西志，鄧明俊，岳志芹，孫 濤，趙玉然

（山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002）

馬媾疫（Dourine）是由錐蟲屬（Trypanosoma）的馬媾疫錐蟲（Trypanosoma equiperdum）寄生于馬屬動物的生殖器官所引起一種寄生蟲性傳染病。該病不同于其他錐蟲病，可通過感染馬與健馬交配傳染[1]。

目前，國內對于媾疫錐蟲病的診斷主要是通過病原學和血清學檢測兩種方法。病原學診斷雖然可以確診，但費時費力，而且檢出率低[2]。血清學診斷中ELISA基本上是全蟲提取抗原，特異性較差；補體結合試驗操作繁瑣耗時，而且影響因素過多，判定比較困難。研究顯示，錐蟲不同亞種蟲株的基因組中存在某些差異[3-4]。本研究利用錐蟲基因組中存在的差異，通過熒光定量PCR技術建立了一種特異的、快速的媾疫錐蟲檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株和蟲株 馬鼻肺炎病毒（Equid herpesvirus，EHV）、馬動脈炎病毒（Equine arteritis virus， EAV）和 馬 流 感 病 毒 （Equine influenza virus，EIV）由本實驗室保存；馬媾疫錐蟲美國株基因組、伊氏錐蟲美國株基因組和馬焦蟲德克薩斯株基因組由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒、ExTaqPCR試劑盒、連接試劑盒、DH5a、pMD18-T、DNA Marker DL2000和AMV反轉錄酶均購自TaKaRa公司；Power SYBRRGreen PCR Master Mix購自ABI公司；PureLink Micro-to-M idi Total RNA Purification System購自Invitrogen公司。

1.3 引物設計 根據(jù)GenBank登錄的馬媾疫錐蟲Maxicircle DNA基因序列（EU185800.1），參照文獻[3]的報道，選擇其保守區(qū)域，利用Primer primer5.0軟件設計一對基因片段克隆引物，D1-F：5'-TGGGTTTATATCAGGTTCATTTATG-3'和 D1-R：5'-CCCTAATAATCTCATCCGCAGTACG-3'。

選取保守區(qū)域設計熒光定量PCR的引物，P1：5'-TGTTTTATAGTATTTTACGCA-3'和 P2：5'-ATCT CATCCGCAGTACGCTGT-3'，擴增長度為 151 bp，由TaKaRa公司合成。

1.4 病毒DNA和RNA的提取及其cDNA的制備各取病毒液100μL，按照DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取病毒液100μL按照試劑盒的說明書提取病毒RNA，用AMV反轉錄酶按照說明書反轉錄合成cDNA。

1.5 馬媾疫錐蟲基因特異性保守片段的擴增 以馬媾疫錐蟲基因提取物為模板，采用引物D1-F、D1-R進行PCR擴增。反應條件為 94℃ 5 Min；94℃1 Min，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃10 Min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.6 SYBR GreenⅠ熒光PCR標準品的制備 將PCR產物切膠回收，連接至pMD18-T載體，轉化DH5α，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落，擴大培養(yǎng)后提取重組質粒，挑選經PCR鑒定正確的重組質粒，由上海英駿（Invitrogen）生物技術有限公司測序。將測序正確的重組質粒命名為pMD-Dourine。

提取重組質粒，用Pico drop測定質粒濃度，參照以下公式計算拷貝數(shù)：copies=ng×10-9×6.02×1023/堿基數(shù)×345。

1.7 SYBR GreenⅠ熒光PCR反應體系和反應條件的優(yōu)化 以樣本閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）、產物熒光值、標準曲線斜率和相關系數(shù)等為標準，分別對PCR反應體系中的引物、dNTP、Mg2+濃度和反應參數(shù)中退火溫度、讀板溫度進行優(yōu)化。

1.8 標準曲線的建立 用10倍系列稀釋法處理pMD-Dourine為標準品。取6個濃度梯度（105、104、103、102、101、100拷貝）質粒標準品作為模板，以優(yōu)化的反應體系和反應參數(shù)進行 SYBR GreenⅠ熒光PCR反應。根據(jù)熒光實時PCR的動力學曲線，檢測儀系統(tǒng)自動生成標準曲線以及回歸方程。

1.9 SYBR GreenⅠ熒光PCR方法特異性、敏感性試驗 分別提取馬EHV、EAV、EIV、馬媾疫錐蟲、馬伊氏錐蟲和馬焦蟲的核酸，用所建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR進行檢測，設無模板陰性對照。收集熒光信號，檢測其特異性。

用ddH2O對標準模板進行10倍系列稀釋，用所建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對各個稀釋的樣品進行檢測。與此同時，將10倍系列稀釋的標準模板進普通PCR檢測，電泳觀察結果。

1.10 SYBR GreenⅠ熒光PCR方法的重復性試驗將10倍系列稀釋的標準品在同一時間、同一地點做3次重復以及在不同時間，不同地點做3次重復，根據(jù)優(yōu)化的SYBR GreenⅠ熒光PCR反應體系和反應條件進行重復性試驗。并分別計算組內及組間的變異系數(shù)。

2 結果

2.1 標準陽性模板的制備 將擴增得到的馬媾疫錐蟲基因特異性保守片段克隆至pMD-18T載體中，利用PCR對構建的重組子進行鑒定，得到約400 bp的片段（圖1）。測序結果為395 bp，與GenBank中登陸序列（EU185800.1）同源性達到100%。

2.2 標準曲線的建立 利用試劑盒提取pMD-Dourine重組質粒，并測定其OD值，通過公式計算得到其濃度為3.8×1010拷貝/μL。稀釋質粒至1.0×109拷貝/μL作為原液使用。

將含有1.0×109拷貝/μL的重組質粒原液10倍倍比稀釋，分別以 1拷貝 /μL～1.0×105拷貝 /μL稀釋度的重組質粒為標準品進行定量PCR擴增。用Sequence Detector software進行數(shù)據(jù)分析，以起始模板的拷貝數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標繪制標準曲線（圖2）。圖2顯示，Ct值與拷貝數(shù)濃度在1拷貝/μL～1.0×105拷貝/μL之間呈線性關系，而且R2為0.995。熒光定量PCR的溶解曲線圖顯示，標準品擴增產物的溶解溫度為71℃（圖3）。

圖1 重組質粒pMD-Dourine的PCR鑒定結果Fig.1 Identification of recombinant plasm id

圖2 采用SYBRGreenⅠ實時定量PCR檢測標準曲線Fig.2 Standard curve of Dourine detected by SYBR GreenⅠreal-time PCR

2.3 SYBR GreenⅠ熒光PCR方法特異性、敏感性 使用建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對EHV、EAV、EIV、馬焦蟲、伊式錐蟲和馬媾疫錐蟲的陽性DNA樣本進行檢測，只有馬媾疫錐蟲樣本呈現(xiàn)擴增曲線（圖4）。將標準品質粒10倍比稀釋，圖5中試驗結果顯示，所建立的檢測方法在1拷貝/μL時，仍有熒光信號。

2.4 熒光定量PCR的重復性試驗 分別以105、104、103、102、101和 100拷貝 /μL 的 pMD-Dourine為模板進行組內及組間的重復性試驗，記錄Ct值并計算變異系數(shù)（表1）。通過計算組內的變異系數(shù)為0.305%～3.360%，組間變異系數(shù)為1.491%～3.183%，表明該方法具有良好的重復性。

圖3 標準品的熔解曲線Fig.3 Themelting curve of standards

圖4 馬媾疫錐蟲實時定量PCR特異性檢測Fig.4 Specificity of the real time PCR method for detecting T.equiperdum

表1 SYBR GreenⅠ實時熒光PCR的組內、組間重復性實驗結果Table 1 Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of the SYBR Green I real-time PCR

圖5 標準品質粒擴增曲線Fig.5 The amplification curve of standard plasm ids

4 討論

隨著經濟全球化的進展，國際間馬匹的交流也越來越頻繁，建立快速高效敏感的馬病檢測方法，對于保障人們的健康和預防疫情的爆發(fā)具有重要意義。本實驗采用SYBR GreenⅠ染料法建立了馬媾疫錐蟲的熒光PCR檢測體系。

近年來熒光定量PCR技術憑借其自身檢測范圍寬、敏感性高、精確度高、無PCR后處理步驟、無交叉污染及高通量，可以進行多重檢測等優(yōu)點，廣泛的應用于各個研究領域[5-6]，成為目前應用的最熱門的技術之一。

由于SYBR GreenⅠ與雙鏈DNA的結合是非特異性的，在PCR過程中產生非特異產物或引物二聚體對定量結果均有影響，因此需要優(yōu)化反應條件，并對產物進行熔解曲線分析。Li等研究顯示在馬媾疫錐蟲與伊式錐蟲的動肌體基因中存在差異[3]，本研究根據(jù)對GenBank中登錄的錐蟲的動肌體基因對差異序列進行了分析，通過軟件設計了特異性引物，從根本上避免了PCR擴增過程中非特異性擴增的發(fā)生。同時本研究中通過對MgC12反應濃度和引物濃度的優(yōu)化，減少了引物二聚體的產生和影響，并且反復試驗，溶解曲線圖中顯示，試驗中并無非特異性擴增的影響。

本實驗建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，對馬媾疫錐蟲DNA的檢測下限達到10拷貝；特異性試驗表明，該方法對馬伊氏錐蟲、馬焦蟲、EHV、EAV、EIV無交叉反應，具有良好的特異性。綜上所述，本實驗建立了靈敏、快速、特異的馬媾疫SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，該方法在進出境動物檢驗檢疫、流行病學調查及寄生蟲病原鑒定中具有重要的應用價值。

[1]王玉玲.馬媾疫微量補體結合的改良試驗[J].中國動物檢疫，2003，20（6）：23-25.

[2]董文其，孫恩貴，劉俊華.媾疫錐蟲、伊氏錐蟲差異抗原的分離鑒定[J].中國畜禽傳染病，1993，69（2）：46-47，41.

[3]Li Feng-jun,Gasser R B,Lai De-hua,et al.PCR approach for the detection ofTrypanosomabrucei andT.equiperdumand their differentiation fromT.evansibased on maxicircle kinetoplast DNA[J].Mol Cell Probes,2007,21（1）:1-7.

[4]Claes F,Radwanska M,Urakawa T,et al.Variable surface glycoprotein RoTat 1.2 PCR as a specific diagnostic tool for the detection ofTrypanosoma evansiinfections[J].Kinetoplastid Biol Dis,2004,3（1）:3.

[5]Kimberly E R,Hansjuerg A,Hagan JP,et al.The detection of differentially expressed MicroRNAs from the serum of ovarian c ancer patients using a novel real-time PCR platform[J].Gynecol Oncol,2009,112（1）:55-59.

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