程結(jié)南,李 平,程 躍,章文信,蔡亞非

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,蕪湖 241000)

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,STK)是細(xì)胞中廣泛存在的一種化學(xué)酶,其家族包括很多成員,主要是通過特異地催化蛋白質(zhì)的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化來參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生命活動。小鼠STK31基因位于第6號染色體上,其編碼產(chǎn)物含有1018個氨基酸。目前已發(fā)現(xiàn)STK31與癌癥及精子發(fā)生相關(guān),而與脊髓損傷的關(guān)系還未見報道。本文旨在結(jié)合我們實驗室前期工作并通過分子手段來確定STK31與脊髓損傷的潛在關(guān)聯(lián),為脊髓損傷研究提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 實驗動物為本實驗室繁殖的7～8周齡成年昆明小白鼠。隨機挑選50只健康小白鼠,分為空白對照組和脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)處理組,其中空白對照組(A組)為假損傷組,只切開椎板不進行損傷處理即縫合;SCI處理組被設(shè)置為5個小組(n=5):B(損傷后4 h)、C(損傷后8 h)、D(損傷后1 d)、E(損傷后3 d)、F(損傷后7 d)。

1.1.2 儀器及試劑 Ultrospec 4300紫外分光光度計為瑞士安法瑪西亞公司產(chǎn)品;ABI 7300 PCR擴增儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司產(chǎn)品;RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑購自上海生工;DNA擴增試劑及標(biāo)準(zhǔn)品購自廣州市達暉生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 制作脊髓損傷模型 使用Nystrom法構(gòu)建脊髓損傷模型。腹腔注射5%的水合氯醛麻醉小鼠,使其俯臥在實驗手術(shù)臺上并固定,沿著T8中線切開背部皮膚及附著組織,除去錐板,小心暴露脊髓,并用重物壓迫脊髓,以下肢劇烈收縮作為其有效性的依據(jù),壓迫面積0.1 cm×3 cm,壓迫5min,使小鼠脊髓中度受傷,然后移去重物,用生理鹽水沖洗傷口后進行縫合;對照組只切開錐板不對脊髓進行損傷處理。每天3次對截癱動物的膀胱區(qū)進行人工按壓排尿,并防止并發(fā)癥。觀察記錄各組小鼠雙下肢的肌張力、反射及其大小便等一般情況。

1.2.2 取材 在各個時間點分別取SCI實驗組及對照組小鼠各5只,在冰上處死,迅速取出損傷后的脊髓組織(脊髓損傷段上下約1 cm)及適量肺、脾、胸腺、腎、胃、心臟、大腦組織放入液氮罐中保存以備后緒實驗用。

1.2.3 RNA提取 使用Trizol法來提取總RNA。取適量凍存的實驗材料,加液氮研成粉末,迅速轉(zhuǎn)移至裝有3 ml預(yù)冷提取液的10 ml離心管中,混勻,依次加入0.3mlNaAc(2 mol/L,pH 4.0)、3 ml水飽和苯酚和 0.6ml氯仿-異戊醇(24∶1)充分混勻,冰浴15 min,4℃13 000 r/min離心30 min,將上層水相轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中,加入等體積的預(yù)冷異丙醇,混勻,置于-20℃2 h。4℃13 000 r/min離心30 min,去上清,將沉淀用75%的乙醇洗2次,稍晾干,將沉淀溶于100 μ l DEPC處理過的超純水中,4℃16 000 r/min離心30 min。使用分光光度計檢測RNA的濃度和純度,并用1%甲醛變性瓊脂糖電泳來檢測其完整性,-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 cDNA的合成 根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA,70℃水浴10 min后儲存于-20℃冰箱備用。

1.2.5 半定量 RT-PCR 用Oligo v6.0來設(shè)計STK31基因的引物,其登錄號、序列及退火溫度見表1。在實驗中實施雙管法,以β-actin基因作為內(nèi)標(biāo),β-actin基因引物為:上游引物(5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′);下游引物(5′-CCACAGGA TTCCATACCCAA-3′)。以cDNA為模板在相同的反應(yīng)條件下擴增STK31和β-actin基因片段,PCR反應(yīng)混合體系為:2.5 μ l10 ×PCR 緩 沖液(包含 Mg2+)、2 μ g 的 cDNA、0.5 μ l 10 mmol/L的dNTPs、1U的DNA聚合酶、上游引物及下游引物各2 μ l,加無菌水補至 25 μ l。 PCR 反應(yīng)程序為:94℃ 5 min,94℃45 s、57.4℃ 30 s和 72℃ 60 s共 30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測,拍照,通過Bandscan 5.0軟件分析各膠帶總灰度面積及灰度值,并得出STK31基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 STK31基因在小鼠各組織中的表達特異性

通過半定量RT-PCR,結(jié)果顯示STK31基因在小鼠的腎、胃、胸腺、脊髓、肺、脾、心臟、大腦等多個器官組織中都有表達,且在脊髓中表達明顯(圖1)。

Fig.1 Expression of STK31 gene in various tissues

2.2 脊髓損傷后不同時間STK31基因的差異表達

半定量RT-PCR擴增STK31和β-actin基因所得到的產(chǎn)物和預(yù)期的一樣(圖2),在各實驗組中STK31基因都普遍表達。用Bandscan軟件計算兩基因的相對表達量,并經(jīng)SPASS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示STK31基因的表達量在損傷后4 h和1 d兩組顯著低于對照組(P＜0.01),而且在4 h、8 h、1 d、3 d呈現(xiàn)降低-回升-降低-回升的趨勢(圖 3)。

3 討論

脊髓損傷不僅會導(dǎo)致神經(jīng)組織出現(xiàn)即刻損傷,如:局部機械性損傷、缺血、細(xì)胞壞死等,往往還會引發(fā)更為復(fù)雜的繼發(fā)性損傷,而炎癥是脊髓損傷特別是繼發(fā)性損傷過程中重要的病理反應(yīng)。目前對脊髓損傷修復(fù)的分子機制研究大多集中于炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)基因,細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及神經(jīng)修復(fù)維護相關(guān)基因上,其中就包含細(xì)胞中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員。

Fig.2 Electrophoresis photo of semi-quantitative RT-PCR of STK31 and β-actin gene

STK31是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員,結(jié)構(gòu)保守,包括三個結(jié)構(gòu)域:tudor結(jié)構(gòu)域、SbcC結(jié)構(gòu)域和絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域,其中tudor結(jié)構(gòu)域在一些RNA結(jié)合蛋白中頻繁出現(xiàn),或具有RNA結(jié)合功能,并已發(fā)現(xiàn)在果蠅發(fā)育中起重要作用,SbcC結(jié)構(gòu)域具ATP酶功能可能參與DNA修復(fù),激酶結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)C端,包含絲氨酸/蘇氨酸激酶家族所有預(yù)期保守氨基酸序列[1]。已發(fā)現(xiàn)STK31在人,馬科動物、嚙齒動物的睪丸組織和動物胚胎腦組織中特異表達[1];此外STK31還在多種腫瘤組織中高度表達,具有促進腫瘤發(fā)生的作用[2]。然而,STK31與脊髓損傷的相關(guān)性研究至今仍未見報道。本實驗通過 R T-PCR技術(shù)檢測到STK31可在小鼠腎臟、胃、脊髓、腦、心臟等多種器官中表達,且在脊髓中表達明顯(圖1)。在小鼠脊髓損傷后STK31出現(xiàn)兩次顯著的下調(diào)表達(P＜0.01,圖 3),由此推斷 STK31基因可能參與小鼠SCI后的信號調(diào)控。目前對絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員的研究表明其作用范圍廣泛,包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)與維護,細(xì)胞自我吞噬調(diào)節(jié),免疫反應(yīng)調(diào)節(jié),鈣離子調(diào)節(jié),細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)等。范睿[3]等發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后4 h開始出現(xiàn)大量神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,其中促凋亡因子表達上升,抑凋亡因子表達下降。Sakurai[4]等認(rèn)為絲氨酸/蘇氨酸激酶在脊髓損傷早期能延緩神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。本文結(jié)果顯示SCI后4 h、8 h、1 d、3 d時STK31表達呈現(xiàn)降低-回升-降低-回升的趨勢,而STK31的下調(diào)表達可能會加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡。此外絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶涉及免疫反應(yīng),而其表達量的恢復(fù)可能與相繼的免疫反應(yīng)強化有關(guān),這還需進一步驗證。STK31與另一種絲氨酸/蘇氨酸激酶Camk4(鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶)功能類似,暗示結(jié)構(gòu)保守的STK31可能通過鈣調(diào)節(jié)作用來參與細(xì)胞應(yīng)答,而鈣離子在腦和脊髓損傷特別是之后的繼發(fā)性損傷中發(fā)揮著重要的作用[5]。

[1]Sabeur K,Ball BA,Corbin C J,et al.Characterization of a novel,testis-specific equine serine/threonine kinase[J].Mol Reprod Dev,2008,75(5):867-873.

[2]Yokoe T,Tanaka F,Mimori K,et al.Efficient identification of a novel cancer/testis antigen for immunotherapy using three-step microarray analysis[J].Cancer Res,2008,68(4):1074-1082.

[3]范 睿,魯亞平,蔡亞非,等.小鼠脊髓挫傷型損傷后caspase-3、bax、bcl-2和 c-kit基因的表達[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,33(1):87-89.

[4]Sakurai M,Hayashi T,Abe K,et al.Induction of phosphatidylinositol 3-kinase and serine-threonine kinase-like immunoreactivity in rabbit spinal cord after transient ischemia[J].Neurosci Lett,2001,302(1):17-20.

[5]Wu J Y,Ribar T J,Cummings D E,et al.Spermiogenesis and exchange of basic nuclear proteins are impaired in male germ cells lacking Camk4[J].Nat Genet,25(4):448-452.