曹廣運(yùn),謝瑞芹,崔 煒,劉 凡,劉 靜,魯靜朝,任慧敏,呼海娟

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科,石家莊 055550)

冠心病是影響人們身體健康的重要疾病,其中急性心肌梗死是危及人們身體健康的重要原因之一。在急性心肌梗死病人中,無(wú)論是藥物溶栓還是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)或冠脈搭橋,及時(shí)有效恢復(fù)灌注是挽救心肌的重要治療措施。然而再灌注治療卻不可避免的引起缺血/再灌注損傷。因此,如何減少心肌的缺血/再灌注損傷是目前研究的熱點(diǎn)。

近年來(lái),人們對(duì)減少心肌缺血/再灌注損傷的方法進(jìn)行了深入的研究,發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)均是減少心肌缺血/再灌注損傷的有效方法,而缺血后適應(yīng)因其實(shí)用性和可操作性逐漸被學(xué)者所關(guān)注。

缺血后適應(yīng)又稱為缺血后處理,其包括心肌本身的缺血后適應(yīng)和其它器官對(duì)心肌的缺血后適應(yīng),也稱為遠(yuǎn)端缺血后適應(yīng),如腎臟、小腸等的缺血后處理都可減少心肌的缺血/再灌注損傷[1]。在遠(yuǎn)端器官中,骨骼肌以其對(duì)缺血的耐受性強(qiáng)和操作方便有可能成為心臟保護(hù)的首選器官。但骨骼肌缺血后處理和心肌的缺血后處理對(duì)心臟保護(hù)作用是否存在差異,以及兩者聯(lián)合后心臟保護(hù)作用是否可以疊加目前研究較少。本實(shí)驗(yàn)預(yù)對(duì)此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭大白兔30只,雌雄不拘,體重2.5～3.0 kg。所有動(dòng)物隨機(jī)分為5組(n=6):缺血對(duì)照組(Con)、假手術(shù)組(sham)、心肌缺血后處理組(myocardial ischemic postconditioning,MPostC)和肢體缺血后處理組(remote postconditioning,RPostC)及心肌缺血后處理聯(lián)合肢體缺血后處理組(MPostC+RPostC)。

1.2 模型制備

1.2.1 心肌缺血/再灌注模型制備 兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,氣管插管,連接小型動(dòng)物呼吸機(jī),以1 L/min的速度給予富含100%氧氣的氣體。心電圖機(jī)針形電極插于動(dòng)物四肢皮下,分離左頸總動(dòng)脈插管連接壓力換能器監(jiān)測(cè)血壓(BP)和心率(HR)。游離右頸總靜脈及雙側(cè)髂外動(dòng)脈備用。

小止血鉗夾斷3、4肋軟骨,鈍性分離,鉗夾肋間內(nèi)、外肌止血。上、下緣游離出2.5 cm左右的縱行切口,剪開縱隔胸膜,露出心包,暴露心臟。并游離頸動(dòng)脈備用。找出左冠狀動(dòng)脈的旋支及左室支。眼科5-0針線縫扎左室支中點(diǎn)處(以左心耳到心尖連線的中點(diǎn)平面),以內(nèi)徑0.5 cm的硅膠管套線,束緊后緊貼硅膠管的上端用止血鉗夾緊線觀察:(1)心肌的顏色變化:由紅色變暗灰色。(2)結(jié)扎前、后心電圖改變 :Ⅱ、Ⅲ、aVF導(dǎo)聯(lián)ST段抬高,為心肌缺血成功。松開套管后心肌顏色迅速恢復(fù)為原來(lái)紅色為心肌再灌注成功。

1.2.2 骨骼肌缺血/再灌注模型 采用2%利多卡因局麻雙側(cè)腹股溝區(qū),直視下分離雙側(cè)髂外動(dòng)脈,動(dòng)脈夾鉗夾固定部位阻斷遠(yuǎn)端血流,通過(guò)結(jié)扎遠(yuǎn)端動(dòng)脈搏動(dòng)的有無(wú)反映下肢血流的阻斷情況。

1.3 分組處理

缺血/再灌注模型制作成功,血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定10 min后按以下程序分組進(jìn)行干預(yù)。(1)缺血對(duì)照組(Con):按如上步驟致使兔心肌持續(xù)缺血45 min,然后再灌注120 min。(2)假手術(shù)組(Sham):麻醉,暴露心臟,分離左室支,穿線但不接扎。(3)近端后處理組(MPostC):在心肌缺血末再灌注開始時(shí),對(duì)結(jié)扎的左室支給予開通20 s-閉塞20 s,即R/I循環(huán)3次,后再灌注至 120 min。(4)遠(yuǎn)端后處理組(RPostC):分離雙側(cè)髂外動(dòng)脈,在心肌缺血末再灌注開始前12 min,用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)髂外動(dòng)脈,行缺血5 min-開通1 min,即I/R循環(huán)2次,并于心肌再灌注時(shí)同時(shí)松開雙側(cè)髂外動(dòng)脈,與心肌同時(shí)灌注至120 min。(5)近端后處理+遠(yuǎn)端后處理組(MPostC+RPostC):心肌缺血45 min后分離雙側(cè)髂外動(dòng)脈,在缺血末再灌注開始前12 min夾閉,行缺血5 min-開通1 min,即I/R循環(huán)2次,于心肌再灌注時(shí)同時(shí)松開夾閉的雙側(cè)髂外動(dòng)脈,與心肌同時(shí)灌注至120 min。同時(shí),在缺血末再灌注開始時(shí),對(duì)結(jié)扎的左室支給予開通20 s-閉塞20 s,即R/I循環(huán)3次,后再灌注至120 min。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 實(shí)驗(yàn)時(shí)分離左頸總動(dòng)脈插管連接壓力換能器與SMUP-PC1型生物信號(hào)處理系統(tǒng)相連,以biopac Systems AcqKnowledge軟件記錄血壓(blood pressure,BP)和心率(heart rate,HR)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。

1.4.2 心肌梗死范圍測(cè)定 于再灌注末原位重新結(jié)扎左室支,從耳緣靜脈注入2%Evans藍(lán)3 ml～4 ml,2 min后剪下心臟,去除雙房及右室,-20℃冰凍,沿左心室(LV)長(zhǎng)軸橫切為厚約2 mm的心肌8～9片,數(shù)碼相機(jī)連續(xù)拍照,分離缺血區(qū)和非缺血區(qū)。將缺血心肌置入TTC磷酸緩沖液中染色,數(shù)碼相機(jī)連續(xù)拍照,分離壞死區(qū)和非壞死區(qū)。以圖像處理軟件(Photoshop及image-Pro Plus圖像處理系統(tǒng)計(jì)算各部分面積。以缺血區(qū)面積/左室面積代表缺血區(qū)范圍;以壞死區(qū)面積/缺血區(qū)面積表示壞死區(qū)范圍。

1.4.3 心肌酶測(cè)定 分別于結(jié)扎冠脈前及缺血末、再灌注60 min及120 min時(shí),從右頸動(dòng)脈抽血2 ml,3 500 r/min,離心10 min,分離血清,-80℃保存待測(cè)。采用生化分析儀連續(xù)監(jiān)測(cè)法統(tǒng)一測(cè)定CPK及LDH含量,藥盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所,所有試劑均為分析純。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

從表1可看出,缺血前各組間心率(HR)和平均動(dòng)脈壓(MAP)均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。缺血期,各組MAP和HR亦無(wú)顯著差異(P＞0.05,表1,2)。這樣可以保證各組在相似的血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)下行缺血/再灌注處理,不致因血流動(dòng)力學(xué)不同而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Tab.1 Changes of HR in different groups(Beats/min,±s,n=6)

Tab.1 Changes of HR in different groups(Beats/min,±s,n=6)

HR:Heart rate;Con:Control group;Sham:Sham operation group;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group

Group Baseline 45 min after ischemia 60 min after reperfusion 120 min after reperfusion Con 244.83±32.63 226.33±47.24 231.67±31.73 223.83±29.27 Sham 220.00±25.61 224.23±30.21 230.32±26.78 216.26±21.32 MPostC 210.00±58.99 226.67±16.33 206.67±12.11 206.67±20.66 RPostC 233.00±16.24 221.17±16.02 227.50±12.72 234.50±12.18 MPostC+RPostC 228.33±39.71 220.83±2.04 193.33±27.33 175.00±37.82

Tab.2 Changes of MAP in different groups(mmHg,±s,n=6)

Tab.2 Changes of MAP in different groups(mmHg,±s,n=6)

MAP:Mean artery pressure;Con:Controlgroup;Sham:Sham operationgroup;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group

Group Baseline 45 min after ischemia 60 min after reperfusion 120 min after reperfusion Con 77.83±10.36 68.67±4.76 77.67±14.08 78.00±12.93 Sham 80.23±12.23 78.65±5.36 82.58±6.89 90.00±9.36 MPostC 104.83±34.76 92.67±40.63 88.00±24.65 92.00±28.20 RPostC 83.17±5.15 80.17±6.67 90.33±10.80 93.17±8.03 MPostC+RPostC 100.00±7.69 73.83±11.20 91.00±7.62 90.67±2.73

2.2 心肌缺血范圍和梗死范圍比較

各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由結(jié)扎冠脈所造成的心肌缺血范圍(AAR/LV)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。除假手術(shù)組(Sham)外,各處理組與缺血對(duì)照組(Con)相比,壞死范圍(AN/AAR)明顯降低(P＜0.05)。近端后處理組(MPostC)及遠(yuǎn)端后處理組(RPostC)之間心肌AN/AAR無(wú)明顯差異(P＞0.05)。但兩者聯(lián)合后AN/AAR值則明顯降低,與MPostC組及RPostC組分別相比有顯著性差異(P＜0.05,表3)。提示我們相對(duì)缺血對(duì)照組而言,除假手術(shù)組外,各組均對(duì)缺血/再灌注心肌具保護(hù)作用,而近端后處理和遠(yuǎn)端后處理的保護(hù)作用可以疊加。

2.3 各組血漿CPK及LDH含量比較

對(duì)各組血漿CPK及LDH隨時(shí)間的變化趨勢(shì)作圖,可以看出CPK及LDH值在經(jīng)過(guò)處理后1H及2H變化趨勢(shì)較對(duì)照組而言明顯降低(表4)。其中CPK表現(xiàn)尤為典型,隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng),缺血對(duì)照組CPK升高最明顯,近端后處理和遠(yuǎn)端后處理組次之,兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而聯(lián)合處理組更次之,與心肌梗死范圍相對(duì)應(yīng)。

Tab.3 Ratios of AAR/LV andAN/AAR in different groups(±s,n=6)

Tab.3 Ratios of AAR/LV andAN/AAR in different groups(±s,n=6)

Con:Control group;Sham:Sham operation group;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group;LV:Left ventricular;AN:Area of necrosis;AAR:Area at risk*P＜0.05 vs Con group;#P＜0.05 vs MPostC;△P＜0.05 vs RPostC

Group AAR/LV AN/AAR Con 0.3819±0.0710 0.3346±0.0805 Sham× ×MPostC 0.2396±0.0405 0.1809±0.0416*RPostC 0.3666±0.0484 0.1711±0.0774*MPostC+RPostC 0.2655±0.0595 0.0688±0.0536*#△

3 討論

心肌缺血發(fā)生后,早期開通閉塞的冠狀動(dòng)脈,有效恢復(fù)缺血心肌的血液灌注,是限制和縮小梗死面積、改善預(yù)后的關(guān)鍵。然而再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/RI)卻嚴(yán)重影響了血管開通的治療效果。I/RI是指缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞恢復(fù)血供后產(chǎn)生的較為嚴(yán)重的損傷。是一個(gè)涉及多個(gè)方面的復(fù)雜的病理生理過(guò)程。近年來(lái),人們對(duì)減輕I/RI的方法進(jìn)行了較多的研究,如有學(xué)者較多地研究了缺血預(yù)處理,并試圖把它應(yīng)用于臨床實(shí)踐中,但因臨床上心肌缺血事件的不可預(yù)見(jiàn)性使其臨床應(yīng)用受到很大限制。

Tab.4 Data of CPK and LDH in different groups(U/L,±s,n=6)

Tab.4 Data of CPK and LDH in different groups(U/L,±s,n=6)

Con:Control group;Sham:Sham operation group;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group;CPK:Creatine kinase;LDH:Lactate dehydrogenase*P＜0.05 vs con;#P＜0.05 vs MPostC+RPostC

Group Categorization Baseline 45 min after ischemia 60 min after reperfusion 120 min after reperfusion Con CPK 1803.83±499.42 2050.00±591.43 3832.67±894.02 6885.17±1201.82 LDH 165.10±85.17 185.15±100.18 274.15±102.06 324.42±89.01 Sham CPK 1810.33±450.53 1758.67±405.28 1880.17±561.98 1784.50±490.40 LDH 186.23±66.72 188.78±43.73 181.25±42.47 180.00±46.73 MPostC CPK 1907.67±639.90 2072.77±722.89 3249.13±756.12*# 4246.97±871.92*#LDH 63.65±28.52 96.45±33.73 135.47±40.12 249.63±144.23 RPostC CPK 1838.50±661.40 1981.83±724.67 3113.67±788.38*# 3997.33±864.77*#LDH 195.33±79.11 226.30±87.74 251.63±70.36 294.10±95.37 MPostC+RPostC CPK 1833.18±383.76 1982.28±365.48 2266.32±380.15 3122.15±655.56 LDH 79.49±35.56 111.38±50.83 143.55±38.13 221.91±87.99

而缺血后處理(ischemic postconditioning,IPO)作為一項(xiàng)可能行之有效的干預(yù)措施逐漸受到關(guān)注。后處理是指在冠狀動(dòng)脈再灌注開始即刻進(jìn)行短暫、重復(fù)的開通及再閉,隨后恢復(fù)冠脈血流的方法。到目前為止心肌缺血后處理心臟保護(hù)措施已經(jīng)在不同動(dòng)物模型及離體[2]心臟上得到證實(shí),而且已有實(shí)驗(yàn)[3]證實(shí)缺血后處理產(chǎn)生的心臟保護(hù)作用確可達(dá)到與心肌缺血預(yù)處理相似的效果。且有學(xué)者發(fā)現(xiàn),不僅心肌缺血后處理可對(duì)缺血/再灌注心肌產(chǎn)生保護(hù),且體內(nèi)遠(yuǎn)端主要血管的缺血后處理即遠(yuǎn)端缺血后處理也可對(duì)缺血/再灌注的心肌產(chǎn)生保護(hù)[4]。但心臟血管的缺血后處理以及遠(yuǎn)端器官的缺血后處理對(duì)心肌的保護(hù)作用有否差異,以及二者聯(lián)合后能否疊加目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

從本研究可以看出,心臟近端缺血后處理以及遠(yuǎn)端器官缺血后處理均可對(duì)缺血/再灌注心肌產(chǎn)生保護(hù)作用,而且兩種方法同時(shí)實(shí)施,保護(hù)作用可以疊加;但兩種方法之間的心肌保護(hù)作用未見(jiàn)明顯差異。

有關(guān)近端后處理產(chǎn)生的機(jī)制研究較多,目前較為公認(rèn)的是近端后處理產(chǎn)生保護(hù)作用是通過(guò)再灌注損傷補(bǔ)救酶通路(reperfusion injury salvage kinase,RISK)來(lái)完成其保護(hù)作用的,它可能影響線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP),一種在再灌注開始時(shí)開放能促進(jìn)細(xì)胞死亡的非特異性孔的開放,進(jìn)而減少心肌細(xì)胞的壞死[5]。其具體過(guò)程可以分為觸發(fā),調(diào)節(jié)及最終效應(yīng)三個(gè)步驟。

觸發(fā):在后處理過(guò)程中產(chǎn)生或延緩清除的一些物質(zhì)如腺苷和緩激肽(Bradykinin,BK)及阿片類物質(zhì)等作為配體可與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合,導(dǎo)致后處理過(guò)程中的級(jí)聯(lián)效應(yīng),一氧化氮(NO)和活性氧(reactive oxygen species,ROS。需氧細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生一系列活性氧簇,包括 :O2-·、H2O2及 HO2·、·OH等)也可能參與觸發(fā)。

調(diào)節(jié):配體與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合后激活RISK通路,結(jié)果之一就是導(dǎo)致磷酸化的內(nèi)生性一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)增多。這樣,在NOS激活之后,環(huán)化鳥苷酸(cyclic guangylic acid,cGMP)產(chǎn)生,AMP依賴性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase,PKG)激活,然后 ROS產(chǎn)生。而 cGMP、PKG的激活,線粒體KATP的開放和ROS的產(chǎn)生可以被考慮為后處理的中間調(diào)解步驟,這些步驟有可能激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)。有研究證實(shí)在后處理再灌注過(guò)程中,cGMP產(chǎn)物增多,產(chǎn)生抑制MPTP開放的最終效應(yīng)[6]。

最終效應(yīng):再灌注損傷的一個(gè)基礎(chǔ)性步驟就是最終MPTP的開啟。MPTP開啟可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和壞死。而近端后處理可以明顯的降低MPTP的開啟,這樣就能夠有效的避免細(xì)胞的凋亡及壞死的發(fā)生。

同時(shí)后處理時(shí)有效減少細(xì)胞的鈣超載及所造成的低 pH值環(huán)境亦是抑制MPTP開放的重要的原因[7]。

而對(duì)于遠(yuǎn)端后處理而言研究較少,有關(guān)遠(yuǎn)端缺血后適應(yīng)的保護(hù)作用的確切機(jī)制目前尚不清楚。有研究[8]表明非選擇性的腺苷受體阻滯劑8-SPT可以抑制腎動(dòng)脈缺血后適應(yīng)的保護(hù)作用。同時(shí)有研究表明[9]不同的KATP通道阻斷劑消除了后處理的保護(hù)效應(yīng)。以上實(shí)驗(yàn)證明了腺苷、K+ATP通道可能同樣參與遠(yuǎn)端后適應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。但其確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

這樣具體到本研究而言,產(chǎn)生以上結(jié)果可能有如下原因:(1)近端后處理通過(guò)RISK通路起到保護(hù)作用,而遠(yuǎn)端后處理通過(guò)K+ATP通道途徑起到保護(hù)作用,兩者產(chǎn)生保護(hù)作用的途徑不同,故可產(chǎn)生疊加效應(yīng)。(2)近端后處理及遠(yuǎn)端后處理都通過(guò)RISK通路起作用,但由于近端后處理與遠(yuǎn)端后處理過(guò)程中涉及到的缺血肌肉類型不同(心肌與骨骼肌),所以產(chǎn)生的觸發(fā)保護(hù)作用的配體物質(zhì)不同,從而造成兩者的保護(hù)效應(yīng)的疊加。以上只是基于現(xiàn)有研究的推論,確切的機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

綜上所述,心肌的缺血后處理已經(jīng)成為當(dāng)前的一個(gè)熱門研究方向,且目前對(duì)其機(jī)制并不甚明了,本研究通過(guò)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示我們?cè)谂R床上對(duì)于ACS的患者可以采用近端后處理(如介入治療時(shí)球囊擴(kuò)張-收縮)及遠(yuǎn)端后處理(如用止血帶造成遠(yuǎn)端肢體缺血-放開)相結(jié)合的方式來(lái)進(jìn)行急性冠脈介入治療,這樣對(duì)于減少患者心肌再灌注損傷,提高患者生存率及生活質(zhì)量,具有十分重要的意義。

[1]Takaoka A,Nakae I,Mitsunami K,et al.Renal ischemia/reperfusion remotely improves myocardial energy metabolism during myocardial ischemia via adenosine receptors in rabbits:effects of“remote preconditioning”[J].J Am Coll Cardiol,1999,33(2):556-564.

[2]Gho B C,Schoemaker R G,van den DoelM A,et al.Myocardial protection by brief ischemia in noncardiac tissue[J].Circulation,1996,94(9):2193-2200.

[3]Zhao Z Q,Corvera J S,Halkos M E,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):H579-588.

[4]Tsang A,Hausenloy D J,Mocanu M M,et al.Postconditioning:a form of“modified reperfusion” protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway[J].Circ Res,2004,95(3):230-232.

[5]Hausenloy D J,Yellon D M.Survival kinases in ischemic preconditioning and postconditioning[J].Cardiovasc Res,2006,70(2):240-253.

[6]Kulkarni S K,Dhir A.Possible involvement of L-arginine-nitric oxide(NO)-cyclic guanosine monophosphate(cGMP)signaling pathway in the antidepressant activity of berberine chloride[J].Eur J Pharmacol,2007,569(1-2):77-83.

[7]Sun H Y,Wang N P,Kerendi F,et al.Hypoxic postconditioning reduces cardiomyocyte loss by inhibiting ROS generation and intracellular Ca2+overload[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,288(4):H1900-1908.

[8]Kerendi F,Kin H,Halkos M E,et al.Remote postconditioning.Brief renal ischemia and reperfusion applied before coronary artery reperfusion reducesmyocardial infarct size via endogenous activation of adenosine receptors[J].Basic Res Cardiol,2005,100(5):404-412.

[9]Loukogeorgakis S P,Williams R,Panagiotidou A T,et al.Transient limb ischemia induces remote preconditioning and remote postconditioning in humans by a K(ATP)-channel dependent mechanism[J].Circulation,2007,116(12):1386-1395.