王振富,鐘 靈,李玉山

(1.湖北民族學院醫(yī)學院,2.湖北民族學院附屬民大醫(yī)院,恩施 445000)

參附注射液(Shenfu injection,SFI)是根據(jù)古驗方“參附湯”加工提煉而成,由紅參、黑附片組成,主要成分為人參皂苷和烏頭類生物堿等,具回陽救逆、益氣固脫等功效,主要用于陽氣暴脫的厥脫癥和陽虛所致的驚悸、怔忡、喘咳、泄瀉、胃疼、痹癥等?，F(xiàn)代藥理學研究表明,參附注射液可以通過多種途徑對缺血/再灌注損傷有保護作用[1],但其藥理作用尚不十分明確。筆者已做過參附注射液對心肌缺血/再灌注損傷保護作用的研究報道[2],為進一步探討參附注射液對大鼠全腦缺血/再灌注損傷的保護作用及其機制,建立了全腦缺血/再灌注損傷模型(cerebral ischemia/reperfusion,CI/R)。通過對興奮性氨基酸、鈣離子和脂質過氧化物含量以及腦組織含水量和抗氧化酶活性實驗研究。旨在為該藥直接用于防治缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

參附注射液(主要成分為人參皂苷和烏頭原堿,濃度分別為0.8 g/L和0.1g/L,批號080024)由雅安三九藥業(yè)有限責任公司提供;尼莫地平片(山東新華制藥股份有限公司);谷氨酸(glutamate,Glu)、天冬氨酸(asparate,Asp)和甘氨酸(glycine,Gly)對照品(純度99.99%,Sigma公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物工程研究所)

1.2 儀器

LC-10AVP高效液相色譜儀(日本津島);ODSC18色譜柱(美國WATERS公司);RF-530熒光檢測器(日本津島);AA-800原子吸收分光光度計(美國Perkin Elmer公司);UV-265紫外分光光度計(日本津島)。

1.3 實驗動物及分組

SD大鼠,雄性,體重220～250 g,由湖北民族學院實驗動物中心提供。將40只SD大鼠隨機分為4組(n=10):假手術(sham)組、模型對照(CI/R)組、尼莫地平組和參附注射液組。

1.4 大鼠全腦缺血/再灌注模型[3]

將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g/kg),頸部腹側正中縱行切開,分離雙側頸總動脈,置線備用。在枕骨后第一、第二頸椎處切口,手術顯微鏡下分離暴露第一頸椎橫突翼并找到左、右橫突孔,用一直經0.5 mm的電凝針插入橫突孔電凝兩側椎動脈。24 h后,動物清醒,拆除頸部縫合線,用帶硅膠管的動脈夾夾閉兩側頸動脈,10 min后打開動脈夾形成再灌注。再灌注3 h后,取血、取腦進行生化測定。假手術組僅分離頸總動脈,不做結扎與電凝。參附注射液組(10 mg/kg)分別于手術前1 d,術前1 h和再灌注前30 min尾靜脈給藥,共3次。尼莫地平組(30 mg/kg)同時間給藥,假手術組、模型對照組同時間給予同體積的生理鹽水注射。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 腦組織氨基酸遞質含量測定 取左側大腦半球前半部,在冰臺上迅速分離前腦皮質,以冰生理鹽水沖洗后除去殘血,吸干后立即精確稱重,按質量比1∶9加入5%三氯乙酸,高速勻漿機在冰浴下制成10%腦勻漿液,4℃保存待測。測試前保本復溶,4℃12 000 r/min離心10 min,取上清液,檢測條件及方法按文獻[4]的高效液相色譜法(進樣量為100 μ l)測定腦組織谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和甘氨酸(Gly)含量。

1.5.2 腦組織SOD活性和MDA含量測定 取左側大腦半球后半部,冰盤中取腦皮質稱重。在冰浴上按1∶9加入4℃勻漿介質(生理鹽水),高速細胞粉碎機勻漿(14 000 r/min,30 s),3 500 r/min離心10 min。取上清液以考馬斯亮藍法測定蛋白質含量,分裝于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用化學比色法按試劑盒操作說明于紫外分光光度計550 nm波長處測定SOD活性。532 nm波長處測定MDA含量。

1.5.3 腦組織含水量和Ca2+含量測定 取右側大腦半球,稱濕重后置于80℃烤箱中烤至恒重,稱干重,計算腦組織含水量。將烤干腦組織碾碎,精確稱重,加入高氯酸(優(yōu)級純)6 ml和硝酸(優(yōu)級純)1 ml,12 min后,加熱消化,蒸干成鹽狀,去離子水定容,火焰原子吸收法進行腦組織Ca2+含量測定。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0軟件系統(tǒng)進行分析,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,配對t檢驗。

2 結果

2.1 參附注射液對CI/R大鼠腦組織興奮性氨基酸遞質含量的影響

腦缺血/再灌注180 min后,CI/R組大鼠腦組織Glu含量與假手術組比較明顯升高(P＜0.05),Asp和Gly均有降低趨勢,但無統(tǒng)計學意義。與CI/R組比較,參附注射液組能明顯降低Glu含量(P＜0.05),對Asp,Gly含量未見明顯影響(表1)。

2.2 參附注射液對 CI/R大鼠腦組織含水量和Ca2+含量的影

與假手術組比較,CI/R模型組大鼠腦組織含水量和Ca2+含量明顯增加(P＜0.05,P＜0.01),參附注射液能顯著降低CI/R模型組大鼠腦組織含水量和Ca2+含量,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01,表2)。

Tab.2 Effect of Shenfu injection on the contents of CI/R rat brain tissue water and Ca2+(±s,n=10)

Tab.2 Effect of Shenfu injection on the contents of CI/R rat brain tissue water and Ca2+(±s,n=10)

CI/R:Cerebral ischemia/reperfusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham;#P＜0.05,##P＜0.01 vs CI/R

Group Dosage(mg/kg)Wate content(%)Ca2+(μ g/g)Sham 78.04±0.22 176.60±44.58 CI/R 78.77±0.41* 196.51±49.06**Nimodiping 30 78.48±0.84 162.61±49.06 Shenfu injection 10 77.93±0.46# 136.84±38.20##

2.3 參附注射液對CI/R大鼠腦組織SOD活性與MDA含量的影響

與假手術組比較,CI/R模型組大鼠腦組織SOD活性明顯降低,MDA含量明顯升高(P＜0.05)。參附注射液和尼莫地平能顯著升高CI/R模型組大鼠腦組織SOD活性和SOD/MDA比值,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05);對MDA含量有降低趨勢,但無統(tǒng)計學意義(表3)。

Tab.3 Effect of Shenfu injection on activity of the CI/R rat tissue SOD and MDA content(±s,n=10)

Tab.3 Effect of Shenfu injection on activity of the CI/R rat tissue SOD and MDA content(±s,n=10)

SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malondialdehyde;CI/R:Cerebral ischemia/reperfusion*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs CI/R

Group Dosage(mg/kg)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)SOD/MDA Sham 92.48±20.4717.87±32.99 5.37±1.77 CI/R 73.71±13.88*24.22±7.18 3.35±1.22*Nimodiping 30 99.66±31.32#21.94±6.17 4.68±1.34#Shenfu injection 10 98.61±29.33#21.55±4.30 4.59±1.06#

3 討論

腦缺血/再灌注,引起腦組織損傷及機能障礙,其機理尚未完全明了。目前認為,腦缺血/再灌注后的損傷,可能與氧自由基、一氧化氮、細細胞內鈣超載、炎細胞浸潤,興奮性氨基酸的毒性等有關,特別是氧自由基學說在其中占有重要地位[5]。已證明缺血性腦損傷是由于缺血后能量耗竭引起級聯(lián)反應的結果,其激發(fā)點是神經元去極化和細胞外興奮性氨基酸(excitatory amino acid,EAA)含量增加;細胞內Ca2+超載,Ca2+依賴性酶的激活和自由基形成等是興奮性毒性對神經元損傷的重要因素;花生四烯酸代謝產生多種血管活性物質引起的血管收縮和血栓形成,多種細胞毒性細胞因子釋放引起的炎性反應,進一步加重腦缺血和細胞損傷[6]。

另一方面,腦缺血缺氧導致能量代謝耗竭,Na+,K+-ATP酶功能障礙,神經元去極化而觸發(fā)動作電位,神經末梢釋放EAA增加;ATP酶的減少使突觸前膜能量重攝取EAA減少,使大量的EAA聚集于突出間隙。EAA作用于突觸后膜受體,引起配體門控性離子通道開放,Na+Cl-和H2O先后順濃度差、電位差和滲透壓內流,在引起去極化而誘發(fā)動作電位同時,導致突觸后神經元急性腫脹,形成早期細胞損傷。質膜的去極化是電壓門控性Ca2+通道開放,EAA作用于突觸后膜離子型受體開放配體門控性Ca2+通道和胞內升高的Na+濃度使Na+-Ca2+交換增加,Ca2+大量內流造成Ca2+超載;EAA作用于突觸后膜代謝型受體,通過G蛋白偶聯(lián)第二信使,激活磷脂酶 C,分解磷脂肌醇,產生三磷酸肌醇(IP3),作用于內質網膜上特異性受體(IP3R),使內質網釋放Ca2+;此外,由于ATP依賴性Ca2+,泵功能減弱,Ca2+排除減少,進一步加重Ca2+超載[7]。

MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應的產物,可直接反映體內脂質過氧化反應的程度。SOD常作為清除自由基能力的重要指標,SOD活性的高低可反映體內清除自由基的能力。因此測定這些物質的活性或者含量變化可以反映出機體腦組織自由基水平和脂質過氧化反應的強弱,可作為觀察藥物抗腦組織缺血/再灌注損傷作用的有效指標。

腦水腫是腦缺血后病理發(fā)展的必然結果,也是導致神經細胞出現(xiàn)不可逆損害的重要因素之一。缺血引起腦水腫屬于混合性腦水腫,即血管源性水腫與細胞毒性水腫,主要機制是腦內毛細血管通透性增加,大量水腫液滲出并集中在腦實質細胞及血管周圍的細胞間隙內,引起顱內壓增高及實質細胞代謝障礙。

本實驗結果顯示,四動脈阻斷建立大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型,動物出現(xiàn)明顯腦水腫,同時伴有腦組織EAA、Ca2+和MDA含量顯著升高,SOD活性明顯降低。與其他相關報道基本一致[8,9]。參附注射液能明顯減輕腦水腫,顯著升高SOD活性和SOD/MDA比值,顯著降低EAA和Ca2+含量,而對抑制性氨基酸遞質無明顯影響。說明參附注射液通過降低興奮性氨基酸(EAA)毒性、阻滯Ca2+超載和提高抗氧化能力等多種途徑實現(xiàn)對腦缺血/再灌注損傷的保護作用。

[1]鄭曙云,徐建國,趙振中.參附注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2004,24(6):541-544.

[2]王振富.參附注射液對心肌缺血/再灌注損傷血流動力學和心肌酶的影響[J].中國應用生理學雜志,2011,27(2):155-157.

[3]徐叔云,卞如濂,陳 修.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002.1065.

[4]Chen BM,Xia L M,Zhao RQ.Determination of N G,NG-dinmethy larginine in human plasma by higli performance liquid chromgraphy[J].J chormat ography B,1997,692(2),467-471.

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[6]邵福源,王宇卉.分子神經藥理學[M].北京:上海科技術出版社,2005.337.

[7]王 軍,黃啟福,劉惠霞,等.生姜水提物對全腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織氨基酸遞質的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(21):184-187.

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[9]崔景斌,王俊萍,鄢文海,等.大鼠腦缺血再灌注損傷后興奮性氨基酸、NOS和NO的含量變化[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2002,37(2):169.