黨 娜,潘燕霞

(1.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病生學(xué)系,2.福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院康復(fù)治療學(xué)系,福州 350004)

動(dòng)脈壓力感受性反射(arterial baroreflex,ABR)簡稱壓力反射,是維持血壓穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制,它實(shí)時(shí)監(jiān)測血壓波動(dòng),以負(fù)反饋方式保持動(dòng)脈血壓相對(duì)穩(wěn)定。壓力反射功能減弱與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1,2],而且增加腦卒中、致死性心律失常和猝死等心血管事件的發(fā)生[3,4]。因此,探討壓力反射功能減弱的機(jī)制對(duì)預(yù)防高血壓的發(fā)生及不良預(yù)后具有重要意義。

壓力反射功能減弱可發(fā)生在反射弧任何一個(gè)環(huán)節(jié),但主要與動(dòng)脈壓力感受器鈍化和心血管中樞整合功能異常有關(guān)。刺激頸動(dòng)脈竇壓力感受器能降低高血壓說明感受器敏感性降低是壓力反射功能減弱的重要原因之一[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn),高血壓前期患者或者有高血壓家族史的、但血壓正常的年輕人,其壓力感受器功能尚未改變時(shí),壓力反射功能就已降低[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí),自發(fā)性高血壓大鼠(sponta-neously hypertensive rat,SHR)壓力感受器傳入沖動(dòng)正常時(shí),壓力反射功能就已減弱,提示壓力反射功能減弱可能與反射中樞異常有關(guān),但壓力反射功能減弱的中樞機(jī)制目前尚未完全明了。

許多研究表明,高血壓與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。高血壓患者血漿中丙二醛含量增加,而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶及谷胱苷肽過氧化酶等活性下降[6],提示抗氧化能力減弱是造成氧化應(yīng)激的原因之一。應(yīng)用SOD擬似劑Tempol提高抗氧化能力則降低高血壓[7],靜脈給予Tempol還能改善腎性高血壓大鼠受損的壓力反射功能[8],但這主要作用于外周壓力感受器。氧化應(yīng)激對(duì)中樞血壓調(diào)節(jié)的影響尚不清楚。我們先前實(shí)驗(yàn)證實(shí),降低腦內(nèi)活性氧水平能改善心衰大鼠受抑的壓力反射功能[9]。但高血壓狀態(tài)壓力反射功能減弱是否與腦內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)報(bào)道甚少,造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激的原因也不清楚。本實(shí)驗(yàn)以SHR為研究對(duì)象,改變腦內(nèi)活性氧水平,觀察對(duì)壓力反射功能影響,探討腦內(nèi)氧化應(yīng)激與高血壓大鼠壓力反射功能改變的關(guān)系;并檢測腦組織丙二醛代表腦組織氧化應(yīng)激水平,檢測腦組織總抗氧化能力、SOD,CuZn-SOD、過氧化物酶活性以明確中樞氧化應(yīng)激的來源。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

4-羥基-2,2,6,6-四甲基氧基哌啶(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl,Tempol)、二乙級(jí)二硫代氨基甲酸(diethyldithiocarbamic acid,DETC),美國Sigma公司),總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、銅/鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、過氧化氫酶 (catalase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)等試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司),BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 動(dòng)物及分組

10只雄性自發(fā)性高血壓大鼠(330～380 g)為實(shí)驗(yàn)組,12只正常血壓Wistar大鼠為對(duì)照組(體重350～400 g),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.3 動(dòng)物血壓、心率記錄

大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯(800 mg/kg)和α-氯醛糖(40 mg/kg),氣管插管,自主呼吸。右側(cè)股動(dòng)脈插管記錄血壓和平均動(dòng)脈壓(MAP),同側(cè)股靜脈插管用于靜脈給藥。采用標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)記錄心電,心電信號(hào)輸入BL-420F型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成心率(HR),MAP和HR信號(hào)同步保存于BL-420F型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

1.4 壓力感受性反射功能檢測

采用靜脈注射血管舒縮劑改變血壓以激活壓力反射,以壓力反射敏感性(baroreflex sensitivty,BRS)代表壓力反射功能。BRS測定方法:靜脈注射苯腎上腺素 (phenylephrine,PE)3 μ g/kg 、6 μ g/kg 、15 μ g/kg升高血壓,引起反射性心動(dòng)過緩,反映壓力反射對(duì)升壓的敏感性;靜脈注射硝普鈉(sodium nitroprusside,NP)3 μ g/kg 、6 μ g/kg 、15 μ g/kg 降低血壓 ,引起反射性心動(dòng)過速,反映壓力反射對(duì)降壓的敏感性;將血壓變化值與心率變化值進(jìn)行直線回歸分析,該直線的斜率代表BRS。PE和NP交替給藥,兩次給藥間隔10～20 min。

1.5 側(cè)腦室給藥

大鼠頭部固定于腦立體定位儀上,根據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦圖譜進(jìn)行定位。側(cè)腦室坐標(biāo)分別是:前囟后0.8 mm,中線旁開 1.4 mm,顱骨表面下3.8 mm。將微量進(jìn)樣器固定在微操縱器上,用于側(cè)腦室給藥。

為了觀察腦內(nèi)活性氧水平改變對(duì)壓力反射功能的影響,SHR和正常大鼠分成兩組:一組側(cè)腦室注射SOD 擬似劑Tempol(50 μ mol/kg),另一組側(cè)腦室注射 SOD 抑制劑 DETC(50 μ mol/kg),每組 5-6 只 。

Tempol和DETC給藥前,向側(cè)腦室注射生理鹽水(10 μ l/3min)作為對(duì)照,隨后靜脈注射PE(6 μ g/kg)激活壓力感受反射,測定壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity,BRS)。間隔 20～30 min后,側(cè)腦室緩慢注射Tempol或 DETC,給藥體積為 10 μ l,注射時(shí)間給3～4 min,給藥后再測定BRS。實(shí)驗(yàn)結(jié)束,迅速取出全腦組織,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 下丘腦 MDA、T-AOC、SOD、CAT等測定

凍存腦組織在冰盤上分離出下丘腦,按1∶9加入預(yù)冷勻漿緩沖液,電動(dòng)勻漿,低溫離心(3 000 r/min)10 min,保留上清待測。BCA試劑盒測定上清液蛋白濃度。

MDA 、T-AOC、SOD、CAT等試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作,選擇相應(yīng)的波長,用酶標(biāo)儀測定樣品的吸光值,并用樣品蛋白濃度進(jìn)行標(biāo)化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高血壓大鼠MAP、HR、BRS變化

高血壓大鼠MAP(138.5±11.3)mmHg明顯高于正常大鼠(87.4±8.5)mmHg(P＜0.01),HR(344±22)b/min與正常大鼠(328±26)b/min無明顯差別。PE呈劑量依賴性升高血壓,并引起反射性心率減慢(表1),兩組升壓幅度無明顯差異,但高血壓組心率減慢的幅度明顯小于正常組(P＜0.01,表1)。相反,NP則引起劑量依賴性降壓和反射性心率增快,高血壓大鼠降壓幅度明顯大于正常組(P＜0.05),但心率變化卻小于正常組(P＜0.01,表2)。

Tab.1 PEinduced dose-dependent pressor and reflex bradycardia in SHR and control groups(±s)

Tab.1 PEinduced dose-dependent pressor and reflex bradycardia in SHR and control groups(±s)

SHR:Spontaneously hypertention rats;PE:Phenylephrine;MAP:Meah aortic pressure;HR:Heart ratie*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group

Group Δ MAP(mmHg) ΔHR(b/min)Control 3 μ g/kg 17.3 ±4.4 -18.2±2.9(n=12) 6 μ g/kg 27.5 ±5.3 -57.9±7.0 15 μ g/kg 49.7±7.0 -111.8±16.7 SHR 3 μ g/kg 19.6 ±4.3 -15.1±2.4(n=10) 6 μ g/kg 32.6 ±6.6 -41.0±10.5**15 μ g/kg 60.7 ±5.4* -78.7±12.7**

Tab.2 NP induced dose-dependent depressor and reflex bradycardia in SHR and control groups(±s)

Tab.2 NP induced dose-dependent depressor and reflex bradycardia in SHR and control groups(±s)

SHR:Spontaneously hypertention rats;NP:Nitroprusside;MAP:Mean aortic pressure;HR:Heart ratie*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group

Group Δ MAP(mmHg) ΔHR(b/min)Control 3 μ g/kg -9.4 ±3.2 10.6±4.1(n=12) 6 μ g/kg -17.3 ±5.1 23.2±6.81 15 μ g/kg -41.9 ±8.2 54.2±12.8 SHR 3 μ g/kg -13.3 ±3.1 6.6±2.1(n=10) 6 μ g/kg -29.8 ±7.0* 15.9±5.41 15 μ g/kg -55±9.7** 31.7±8.9**

將心率變化與血壓變化進(jìn)行直線相關(guān)分析,該直線的斜率代表平均的BRS。PE誘導(dǎo)高血壓大鼠的BRS為-1.3(r=0.89)明顯小于正常大鼠-2.3(r=0.92,P＜0.01,圖 1);同樣地,NP誘導(dǎo)的BRS,高血壓組為-0.6(r=0.88)也小于正常大鼠-1.3(r=0.94,P＜0.01,圖 1)。

2.2 Tempol和DETC對(duì)高血壓和正常大鼠BRS的影響

為了判斷高血壓大鼠壓力反射敏感性降低是否與腦內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān),側(cè)腦室緩慢注射超氧陰離子捕獲劑Tempol。與注射生理鹽水相比(表3),Tempol能增強(qiáng)高血壓大鼠BRS(P＜0.05),但對(duì)正常大鼠BRS無明顯影響;而側(cè)腦室給予SOD抑制劑DETC,則顯著降低正常大鼠BRS(P＜0.01,表3),DETC輕度抑制高血壓大鼠BRS(P＜0.05)。

Fig.1 Linear regression slopes represent average BRS obtained from the data on MAP-HR relationship induced by phenylephrine and nitroprusside in SHR and Control group

Tab.3 Effects of intracerebroventricular infusion of tempol and DETC on BRS in SHR and control group(±s)

Tab.3 Effects of intracerebroventricular infusion of tempol and DETC on BRS in SHR and control group(±s)

NS:Normal saline;BRS:Baroreflex sensitivity;SHR:Spontaneously hypertention rats*P＜0.05,**P＜0.01 vs NS

Group n BRS BRS NS Tempol NS DETC Control 6 2.1±0.38 2.2±0.45 2.3±0.32 1.52±0.46**SHR 5 1.06±0.361.84±0.31*0.94±0.12**0.61±0.13*

2.3 高血壓大鼠下丘腦MDA含量、總抗氧化能力和抗氧化酶活性改變

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)是代表氧化應(yīng)激水平的重要標(biāo)志物。高血壓大鼠下丘腦MDA明顯高于正常大鼠(P＜0.01,圖2A)。相反,高血壓大鼠下丘腦總抗氧化能力(T-AOC)比正常大鼠降低41%(P＜0.05,圖2B),而且總SOD和Cu-ZnSOD活性較正常大鼠明顯降低(P＜0.05,圖2C;P＜0.05,圖2D)。

過氧化氫酶(CAT)是降解H2O2的抗氧化酶,高血壓大鼠下丘腦CAT為19.7±9.1 U/mg prot。較正常大鼠44.36±15 U/mg prot.降低了53%(P＜0.01)。

3 討論

動(dòng)脈壓力反射功能減弱與高血壓發(fā)病密切相關(guān),本實(shí)驗(yàn)采用血管舒縮劑PE和NP激活壓力反射,以BRS評(píng)價(jià)壓力反射功能。結(jié)果顯示,高血壓大鼠壓力反射調(diào)節(jié)心率的作用明顯降低,無論是PE的升壓還是NP的降壓反應(yīng),高血壓大鼠BRS均明顯低于正常大鼠,表明高血壓狀態(tài)下壓力反射功能減弱。這與高血壓患者[1,2]和高血壓大鼠[8]所觀察的結(jié)果一致。

Fig.2 Changes in MDA content,total antioxidant capacity and antioxidant enzyme activity in hypothalamus.

壓力反射功能減弱主要與感受器敏感性降低和反射中樞整合功能異常有關(guān)。有研究認(rèn)為,高血壓動(dòng)脈硬化降低頸動(dòng)脈竇和主動(dòng)脈弓壓力感受器敏感性,傳入沖動(dòng)減少,導(dǎo)致壓力反射功能減弱,因此,刺激壓力感受器能增強(qiáng)壓力反射功能,產(chǎn)生降壓作用[5]。壓力反射功能降低的外周機(jī)制已有較統(tǒng)一認(rèn)識(shí),但其中樞機(jī)制較復(fù)雜,目前尚未完全闡明。

下丘腦是壓力反射重要的整合中樞,其下行纖維投射到延髓頭端腹外側(cè)區(qū)和脊髓中間外側(cè)柱,影響交感傳出神經(jīng)活動(dòng),從而調(diào)節(jié)壓力反射功能。Gao等[10]報(bào)道心衰家兔延髓頭端腹外側(cè)區(qū)超氧陰離子增加削弱壓力反射功能,我們實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道心衰大鼠壓力反射功能衰減與下丘腦活性氧水平升高密切相關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)也觀察到,高血壓大鼠下丘腦MDA水平明顯高于對(duì)照組,表明壓力反射功能降低與心血管中樞氧化應(yīng)激有關(guān)。為了進(jìn)一步明確氧化應(yīng)激對(duì)壓力反射功能的影響,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用側(cè)腦室給藥,結(jié)果顯示SOD擬似劑Tempol能增強(qiáng)高血壓大鼠壓力反射調(diào)節(jié)心率的作用,恢復(fù)受損BRS;相反,SOD抑制劑DETC則明顯抑制高血壓和正常大鼠壓力反射功能,降低兩組大鼠BRS。Botelho-Ono等[8]人在腎性高血壓大鼠也觀察到,靜脈給予NADPH氧化酶抑制劑apocynin和維生素C能恢復(fù)受損的BRS。上述結(jié)果提示降低氧化應(yīng)激能恢復(fù)受損的壓力反射功能,從另一方面證明中樞氧化應(yīng)激降低壓力反射功能。

機(jī)體氧化應(yīng)激取決于自由基生成與清除之間的平衡,SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶。有報(bào)道,高血壓患者血漿SOD、過氧化氫酶及谷胱苷肽過氧化酶等活性下降[6],提示抗氧化酶活性降低可能是高血壓氧化應(yīng)激的原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高血壓大鼠下丘腦總抗氧化能力低于正常大鼠,總SOD活性和CuZn-SOD活性較正常對(duì)照組分別降低了30%和32%,過氧化氫酶活性也比正常大鼠降低53%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高血壓大鼠中樞氧化應(yīng)激可能源于下丘腦抗氧化酶活性降低。

總之,本實(shí)驗(yàn)證明高血壓壓力反射調(diào)節(jié)心率功能減弱與下丘腦氧化應(yīng)激密切相關(guān),中樞抗氧化酶活性降低可能是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的重要機(jī)制。

[1]Narkiewicz K,Grassi G.Impaired baroreflex sensitivity as a potential marker of cardiovascular riskin hypertension[J].J Hypertens,2008,26(7):1303-1304.

[2] Krontor ádová K,Honz í ková N,Fiser B,et al.Overweight anddecreased baroreflex sensitivity asindependent risk factors for hypertension in children,adolescents,and young adults[J].Physiol Res,2008,57(3):385-391.

[3] Celovská D,Stasko J,Gonsorc í k J,et al.The significance of baroreflex sensitivity in hypertensive subjects with stroke[J].Physiol Res,2010,59(4):537-543.

[4]Johansson M,Gao S A,Friberg P,et al.Baroreflex effectiveness index and baroreflex sensitivity predict all-cause mortality and sudden death in hypertensive patients with chronic renal failure[J].J Hypertens,2007,25(1):163-168.

[5]Heusser K,Tank J,Engeli S,et al.Carotid baroreceptor stimulation,sympathetic activity,baroreflex function,and blood pressure in hypertensive patients[J].Hypertens,2010,55(3):619-626.

[6]Redón J,OlivaM R,Tormos C,et al.Antioxidant activities and oxidative stress by products in human hypertension[J].Hypertens,2003,41(5):1096-1101.

[7]Chen X,PatelK,ConnorsSG,et al.Acute antihypertensive action of Tempol in the spontaneously hypertensive rat[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(6):H3246-3253.

[8]Botelho-Ono M S,Pina H V,Sousa K H,et al.Acute superoxide scavenging restoresdepressedbaroreflex sensitivity in renovascular hypertensive rats[J].Auton Neurosci,2011,159(1-2):38-44.

[9]潘燕霞,王 瑋.中樞活性氧升高介導(dǎo)心力衰竭時(shí)壓力感受性反射功能衰減[J].中國病理生理雜志,2009,25(5):833-838.

[10]Gao L,Wang W,Li Y L,et al.Superoxide mediates sympathoexcitation in heart failure:roles of angiotensin II and NADPH oxidase[J].Circ Res,2004,95(9):937-944.