朱寶亮,趙 穎,劉 景,葛 鳳△,劉樹玲,王俊杰,劉梅芳,顏 紅

(1.濟寧醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,2.生化教研室,3.藥學(xué)院,山東 日照 276826)

在遺傳或環(huán)境等諸多動脈粥樣硬化(artherosclerosis,AS)易患因素中,血清低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平升高是惟一不需要其他危險因素協(xié)同而足以誘發(fā)和推進AS發(fā)生、發(fā)展的危險因素。LDL在體內(nèi)被氧化修飾為氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL,Ox-LDL)后引發(fā)的一系列復(fù)雜的病理生理過程,在AS進程中起著重要作用[1]。Ox-LDL氧化修飾是一個復(fù)雜的過程,其機制尚未充分闡明。內(nèi)皮細胞表面一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)關(guān)鍵輔因子四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)被氧化分解后,NOS脫偶聯(lián),產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),造成機體氧化應(yīng)激狀態(tài)[2]。高脂血癥(hyperlipidemia,HL)也是一種氧化應(yīng)激環(huán)境。本實驗旨在探討HL氧化應(yīng)激在NOS脫偶聯(lián)中的作用及其在LDL氧化修飾中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組和處理

選用8周齡雄性Wistar大鼠54只,隨機分為對照組、高脂飲食組(HL組)和高脂飲食并腹腔注射BH4組(HL+BH4組)(n=18)。HL+BH4組每周2次腹腔注射BH41 mg/kg,對照組注射等容量生理鹽水,于實驗前、實驗8周和16周時各取6只上述三組大鼠,心臟穿刺取血測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、LDL和蝶呤水平。斷頭處死,取胸主動脈再分別進行主動脈勻漿ROS、過氧化脂質(zhì)水平測定。

HL大鼠模型飼料的組成是:1%膽固醇、5%豬油、10%雞蛋黃粉、84%基礎(chǔ)飼料;對照組大鼠進食標(biāo)準大鼠飼料。大鼠每6只一籠,飼養(yǎng)在室溫(25±1)℃和人工光照明暗各12 h的飼養(yǎng)室內(nèi)。各組均自由飲水。

1.2 血脂 、BH4、ROS、LDL 氧化修飾程度和脂質(zhì)過氧化水平測定

1.2.1 血清TC、TG和LDL測定 全血3 000 r/min離心后取血清,用日立7170型全自動生化分析儀檢測TC、TG 和LDL。

1.2.2 LDL氧化修飾程度測定 以硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)生成量代表LDL的氧化修飾程度。取0.1 ml血清與 0.67%TBA 1.0 ml和 10%TCA 1.0 ml混合后置沸水浴15 s,4 000 r/min離心25 min,取上清于波長為532 nm處測吸光度值,以標(biāo)準的四乙氧基丙烷計算含量,結(jié)果以上清液中含有的mmol/L TBARS量表示。

1.2.3 動脈過氧化脂質(zhì)含量測定 用過氧化脂質(zhì)的代謝終產(chǎn)物丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量表示。取大鼠主動脈血管段剪切成小塊并稱重,取50 mg組織放入300 μ l氧飽和的 20℃Krebs液中制成勻漿,離心取上清,按MDA試劑盒說明(硫代巴比妥酸法)用722分光光度計在532 nm處測定每管中硫代巴比妥活性物含量,再根據(jù)公式計算MDA的含量。

1.2.4 BH4及其氧化產(chǎn)物BH2和B的測量 取大鼠主動脈血管段剪切成小塊并稱重,取50 mg組織放入 300 μ l預(yù)冷的提取液 50 mmol/L Tris HCl(pH 7.4),1 mmol/L DTT,1 mmol/L EDTA中進行研磨,離心收集上清并測定蛋白含量,然后加入等體積比的1.5 mol/L HClO4和2 mol/L H3PO4析出蛋白,離心棄去蛋白,取上清;先在酸性條件下氧化:加10 μ l 1%碘液(2%KI配制)混勻,避光置于室溫60 min,取部分標(biāo)本待測;然后于堿性條件下氧化:加入10 μ l NaOH,再加入 10 μ l 1%碘液混勻,避光置于室溫60 min;加入 20 μ l H3PO4酸化標(biāo)本,離心收集上清。使用高效液相色譜法分別對酸性條件下氧化和堿性條件下氧化的標(biāo)本進行測定。酸性條件下氧化的標(biāo)本檢測出總生物喋呤(TB)包括BH4、BH2(二氫生物喋呤)和B(生物喋呤);在堿性條件下氧化的標(biāo)本可以檢測出BH2和B;將BH2和B從總生物喋呤中除去,就是BH4含量。

1.2.5 動脈壁ROS測定 取長2 mm的主動脈環(huán)三段,放置在特制的緩沖液中。緩沖液的成分(mmol/L)包括:145 NaCl,4.86 KCl,5.7 NaH2PO4,0.54 CaCl2,1.22 MgS04,5.5葡萄糖,0.1去鐵敏和1 U/μ l過氧化氫酶。最后加入細胞色素丙(50 μ mmol/L;Sigma C-4186,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)。分別在過氧化物歧化酶(SOD,125 U/ml)存在和不存在的情況下放置在37℃的恒溫箱中60 min。在550 nm處計算細胞色素丙的吸收量,校正背景波長540和560 nm。根據(jù)在SOD存在和不存在的條件下細胞色素丙吸收量的不同計算ROS水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Prism軟件分析和處理相關(guān)數(shù)據(jù)實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示,用t檢驗進行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清TC、TG和LDL水平

實驗前三組大鼠的血清TC、TG和LDL水平無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8周和16周時,HL組和HL+BH4組血清TC、TG和LDL水平較對照組均明顯升高(P＜0.01),但HL組和HL+BH4組之間無明顯差異(P＞0.05,圖1)。

2.2 大鼠動脈勻漿ROS水平分析

實驗前三組大鼠動脈勻漿ROS水平無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8周和16周時,HL組和HL+BH4組勻漿液中 ROS水平均明顯升高(P＜0.01);升高幅度以HL組最為明顯,實驗8周時升高186%,16周達189%。和HL組相比,實驗8和24周時HL+BH4組大鼠勻漿液中的ROS水平均明顯降低(P＜0.01),降低幅度分別為41%和39%(圖2)。

Fig.1 Changes of TG,TC and LDL in HL rats after treating with BH4

Fig.2 Changes of ROS in HL rats after treating with BH4 ROS:Reactive oxygen species;HL:Huperlipidemia;BH4:Tetrahydr-obiopterin

2.3 大鼠動脈勻漿BH4水平變化

實驗前三組BH4和TB水平無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8周和16周時,HL+BH4組較對照組和HL組BH4水平均明顯升高(P＜0.01),提示給予外源性BH4有效提高了動脈中BH4含量;與對照組相比,HL大鼠主動脈血管勻漿中BH4含量明顯降低(P＜0.01),但總喋呤水平(TB=BH4+BH2+B)無明顯差異(P＞0.05),說明HL增加了BH4的氧化(圖3)。

2.4 BH4對大鼠血清Ox-LDL氧化修飾程度的影響

實驗前三組血清TBARS生成量(間接反映Ox-LDL氧化修飾程度)無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8和16周時,HL組和HL+BH4組均較對照組明顯升高(P＜0.01)。與對照組相比,HL大鼠血清中TBARS生成量隨著周齡的增加有逐漸升高的趨勢,在16周齡升高幅度為22%,至24周齡增至43%。和HL組相比,上述HL+BH4組大鼠于實驗8周和16周時血清中TBARS生成量明顯降低(P＜0.01,圖4),說明BH4有阻止LDL氧化修飾的作用。F

Fig.3 Changes of BH4and TB in HL rats after treating with BH4 TB:BH4+BH2+B;BH4:Tetrahydrobiopterin

ig.4 Changes of Ox-LDL in HL rats after treating with BH4 LDL:Low density lipoprotein;HL:Hyperlipidemia;BH4:Tetrahy drobiopterin

2.5 HL大鼠動脈血管壁丙二醛水平變化

實驗前三組大鼠主動脈勻漿中的MDA水平無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8周和16周時,HL組(7.43±1.24;8.24±1.37μ mol/L)和 HL+BH4組(6.42±0.63;7.10±0.86μ mol/L)血清MDA 較對照組(2.26±0.28;2.39±0.43μ mol/L)明顯升高(P＜0.01),但HL+BH4組較HL組MDA明顯降低(P＜0.01),說明BH4有降低動脈血管中MDA的作用(圖5)。

Fig.5 Changes of MDA in HL rats after treating with BH4 MDA:Malondialdehyde;HL:Hyperlipidemia;BH4:Tetrahydrobiopterin

3 討論

AS是全世界危害人類生命健康最嚴重的疾病之一,其患病率和死亡率均居各類疾病之首。LDL在體內(nèi)被氧化修飾為Ox-LDL后引發(fā)的一系列的復(fù)雜病理生理改變是AS氧化應(yīng)激學(xué)說的核心內(nèi)容。Ox-LDL進入內(nèi)皮細胞下組織后,不斷被內(nèi)皮細胞和進入內(nèi)皮下的單核細胞和巨噬細胞進一步氧化修飾為氧化程度更高的Ox-LDL—Hox-LDL(highly oxidized LDL)。Hox-LDL再被巨噬細胞吞噬,最終形成脂肪紋[3]。但內(nèi)皮細胞等氧化修飾LDL的機制尚未闡明。

內(nèi)皮細胞膜的穴樣凹陷中含有大量的NOS。BH4是NOS的關(guān)鍵輔因子,當(dāng)BH4充足時,NOS催化L-精氨酸生成L-胍氨酸和一氧化氮(NO);而當(dāng)BH4水平不足時,NOS催化L-精氨酸氧化不是生成NO,而是.O2-,此種現(xiàn)象稱為NOS脫偶聯(lián)[4]。NOS脫偶聯(lián)產(chǎn)生超氧陰離子(.O2-)在LDL氧化修飾中的作用尚不清楚。

已經(jīng)證明,當(dāng)LDL水平增高時,機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[5]。在LDL氧化過程中,氧自由基攻擊LDL中不飽和脂肪酸上的雙鍵,使之發(fā)生斷裂,先形成不飽和脂肪酸自由基,再氧化成脂過氧基,后者是一種強氧化劑[6]。

BH4是一種還原劑,易被氧化為BH2和B,即失去活性[7]。為了研究脂過氧基對NOS脫偶聯(lián)的影響,即脂過氧基對NOS的關(guān)鍵輔因子BH4的氧化作用,我們檢測了高脂血癥大鼠血清中BH4及其氧化代謝產(chǎn)物BH2和B的水平。結(jié)果表明,在HL大鼠實驗8和16周兩個研究時點,HL組大鼠血清中BH4水平明顯降低,而總蝶呤水平并無明顯差別。提示HL增加了機體BH4的氧化,其原因我們推測可能與HL時脂過氧基增多造成的氧化應(yīng)激環(huán)境有關(guān)。而給予外源性的BH4有效提高了HL大鼠血液BH4的水平。

既然HL時,BH4低于正常,NOS脫偶聯(lián),那么血液中ROS的生成量一定增多,為了研究NOS脫偶聯(lián)在HL氧化應(yīng)激中的作用,本實驗測定了HL大鼠血清中ROS水平,結(jié)果表明在實驗8和16周時,ROS水平比對照組分別增高186%和189%,說明BH4降低導(dǎo)致的NOS脫偶聯(lián)在HL氧化應(yīng)激狀態(tài)的形成有著重要作用。而對HL組大鼠使用BH4治療,其動脈勻漿液中的ROS水平明顯降低(P＜0.01),實驗8和16周時降低幅度分別達到41%和39%,進一步說明上述作用的存在。

本實驗還觀察了通過補充BH4,糾正NOS脫偶聯(lián)對HL大鼠脂質(zhì)過氧化的影響。脂過氧基代謝生成過氧化脂質(zhì),最終大部分生成丙二醛。因此我們采用觀察丙二醛的方法,間接了解機體過氧化脂質(zhì)的水平。至16周以后,HL組和HL+BH4組血清MDA較對照組明顯升高,但HL+BH4組較HL組MDA明顯降低,說明BH4有降低動脈血管中MDA的作用。其機制可能是外源性的BH4糾正NOS脫偶聯(lián),ROS生成減少,而后者降低了LDL脂質(zhì)過氧化。

高脂血癥的主要特征是血液中的LDL水平明顯增高,但血液中 LDL氧化修飾的程度并不高。LDL是一個逐漸氧化修飾的過程[8]。即LDL與內(nèi)皮接觸以及進入內(nèi)皮下間隙時其氧化程度不斷增高。既然高LDL時,脂質(zhì)過氧化增強和NOS脫偶聯(lián),機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài),血液或動脈壁中的ROS和脂過氧基水平均明顯增高。二者結(jié)構(gòu)中均存在游離的電子,是強氧化劑,因此它們在LDL氧化修飾中的作用應(yīng)是一個值得探討的課題。我們的研究表明,HL大鼠血清中TBARS生成量隨著周齡的增加有逐漸升高的趨勢,升高幅度在16周齡時為22%,之后幅度升高逐漸增加,至24周齡增至43%。而給予外源性的BH4,糾正HL大鼠NOS脫偶聯(lián),血液中的Ox-LDL氧化修飾程度明顯降低,提示NOS脫偶聯(lián)在LDL氧化修飾過程中具有重要作用。

綜上所述,我們做如下推理:當(dāng)血液中具有一定氧化程度的Ox-LDL與內(nèi)皮細胞接觸時,其中的脂過氧基氧化內(nèi)皮細胞膜NOS中的BH4,NOS脫偶聯(lián),產(chǎn)生大量的ROS,并繼續(xù)生成大量的脂過氧基。ROS和脂過氧基使Ox-LDL氧化修飾為Hox-LDL,并進一步氧化BH4,加重NOS脫偶聯(lián),造成惡性化的氧化應(yīng)激,這可能是LDL在內(nèi)皮細胞表面氧化修飾的機制。

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