李寶莉,符兆英,陳雅慧,高 楓,張正祥

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西 延安 716000)

卵巢功能衰退,體內(nèi)雌激素水平下降致神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制失衡而出現(xiàn)一系列癥狀,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱為“圍絕經(jīng)期綜合征”,主要采用性激素替代療法,但存在諸多禁忌癥和不良反應(yīng),臨床應(yīng)用受到限制。目前尋找具有雌激素樣生物活性的天然藥物是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),其中延緩卵巢衰老是研究藥物機(jī)理的中心環(huán)節(jié)。本課題采用酸棗仁油、柏子仁油、梔子仁油制備成酸柏梔油軟膠囊,研究其對(duì)雌性去勢(shì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響,初步探討其抗衰老的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性SPF級(jí)SD大鼠60只,3月齡,體重(280±20)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,陜醫(yī)動(dòng)字:08-005。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

酸柏梔油軟膠囊(soft capsule of compound oil of jujube,arboruitae and gardenia,SCCOJAG)是將酸棗仁油、柏子仁油、梔子油按3∶3∶l配伍,由西安東盛醫(yī)藥研究所制備成每粒 0.5 g,批號(hào):081120。乙烯雌酚(Diethylstilbestrol;石家莊市協(xié)和藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào):H13021146)。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

KDC-160HR高速冷凍離心機(jī),MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司制造),TU-1800PC紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。E2、FSH、LH測(cè)定:采用羅氏COBASE411全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(電化學(xué)免疫發(fā)光法),所用診斷試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品均由瑞士羅氏公司提供。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20080913),乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(choline acety ltransferase,ChAT)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20080721),膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20080515)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 實(shí)驗(yàn)與分組

(1)卵巢去勢(shì)組:取50只健康雌性SD大鼠,3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)腹腔注射麻醉,無菌條件下行雙側(cè)卵巢切除術(shù),術(shù)后立即肌注4×105U青霉素預(yù)防感染。隨機(jī)分為5組(n=10):SCCOJAG大、中、小劑量組,乙烯雌酚組,模型組。(2)假手術(shù)組:開腹后不切除雙側(cè)卵巢,僅切除卵巢周圍等體積的脂肪。術(shù)后2周,行陰道脫落細(xì)胞檢查,確定造模成功。手術(shù)4周后開始灌胃給藥,每天1次,連續(xù)12周。大、中、小劑量組分別給予 SCCOJAG 4.50 g/kg 、1.80 g/kg、0.72 g/kg;乙烯雌酚組給予己烯雌酚0.02 mg/kg,模型組和假手術(shù)組均給予等體積的生理鹽水作對(duì)照。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

第121天于給藥后1 h開始訓(xùn)練(每天9∶00-12∶00),水溫保持在(22±2)℃。將水池等分為4個(gè)象限,在任意象限正中離池壁33 cm處放一個(gè)直徑12 cm、高20 cm的平臺(tái),平臺(tái)頂?shù)陀谒? cm。實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于站臺(tái)上適應(yīng)20 s,隨后將大鼠從不同象限入水點(diǎn)背對(duì)站臺(tái)放入水池,記錄大鼠自入水到找到站臺(tái)所需的時(shí)間,記為潛伏期,找到后在平臺(tái)上保持15 s,如2 min內(nèi)找不到,引導(dǎo)到平臺(tái)上保持15 s。每天每只大鼠訓(xùn)練4個(gè)象限,連續(xù)訓(xùn)練5 d。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤掉平臺(tái),選定和平臺(tái)相對(duì)的象限中點(diǎn)為入水點(diǎn),觀察大鼠在120 s內(nèi)跨越原平臺(tái)所在位置的路徑和次數(shù),記錄穿越次數(shù)。訓(xùn)練期間迷宮外參照物保持不變,室內(nèi)保持安靜。

1.6 血樣的收集與檢測(cè)

第126天空腹12 h末次給藥1 h后,3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,頸總動(dòng)脈導(dǎo)管引流取血,低溫離心分離血清,測(cè)定性激素。

1.7 腦組織生化指標(biāo)測(cè)定

(1)組織勻漿制備:取血后,在冰臺(tái)上迅速剝離大腦皮層,冷生理鹽水溶液沖洗殘血,拭干。精確稱取腦組織,置超聲波組織勻漿器中粉碎,加入9倍預(yù)冷的生理鹽水溶液,制成10%的組織勻漿液待測(cè)。(2)測(cè)試方法:NOS、ChAE、AChE的測(cè)定(比色法)嚴(yán)格按試劑說明操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,對(duì)水迷宮重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行一般線性模型(general linear model,GLM)的 Repeated measures和Multivariate,用 Repeated measures單變量方差分析LSD-t檢驗(yàn),實(shí)現(xiàn)每組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的兩兩比較;用Multivariate多元方差分析LSD-t檢驗(yàn),實(shí)現(xiàn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上組間的兩兩比較[1]。其它計(jì)量資料的方差分析采用Univariate中組間LSD-t檢驗(yàn)/Tamhane-t′檢驗(yàn)的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 SCCOJAG對(duì)去勢(shì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

去勢(shì)大鼠的登臺(tái)潛伏期較長(zhǎng),穿越原平臺(tái)次數(shù)較少;SCCOJAG能縮短登臺(tái)潛伏期,增加穿越原平臺(tái)次數(shù),與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各給藥組的潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)增加逐漸縮短也有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,作用類似乙烯雌酚組(表1)。

Tab.1 Influence of SCCOJAG on platform-climbing latency and crossing number in Morris water maze of castrated rats(±s)

Tab.1 Influence of SCCOJAG on platform-climbing latency and crossing number in Morris water maze of castrated rats(±s)

SCCOJAG:Soft capsule of compound oil of jujube,arboruitae and gardenia*P＜0.05 vs model group

Group n D1(S) D2(S) D3(S) D4(S) D5(S) Cross No.in min False operation 10 59.75±38.23 43.15±41.98 28.55±37.78 20.74±20.93 15.35±14.14 2.4±1.2 Model 12 73.50±41.13 58.52±39.45 45.54±33.07 34.91±28.27 28.89±22.14 1.6±1.4 Diethylstilbestrol 9 45.39±45.63 32.27±32.65 22.78±25.49 14.11±10.07*12.37±9.05* 2.8±1.6 Large dosage 7 61.78±49.75 48.35±46.03 33.84±35.90 22.47±20.26 18.45±16.17 1.8±1.7 Middle dosage 7 54.00±35.75 34.31±33.81 24.10±34.77 16.63±15.04 14.63±14.14 2.5±1.4 Small dosage 8 36.66±32.82*25.73±20.04*19.06±15.13*12.19±8.27* 10.68±8.40* 3.5±2.3*

2.2 SCCOJAG對(duì)去勢(shì)大鼠血清雌性激素的影響

去勢(shì)大鼠血清雌二醇(Estradiol,E2)減少,卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)和促性腺激素(Luteinizing hormone,LH)增加;SCCOJAG可顯著升高E2,降低FSH和LH,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以小劑量組作用強(qiáng),作用類似乙烯雌酚組(表2)。

2.3 SCCOJAG對(duì)去勢(shì)大鼠腦內(nèi)NOS、ChAE、AChE的影響

去勢(shì)大鼠腦內(nèi)NOS、ChAE活性較低,AChE活性較高;SCCOJAG可增加腦內(nèi)NOS、ChAE活性,降低AChE活性,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,也以小劑量組作用明顯,作用類似乙烯雌酚組(表3)。

Tab.2 Influence of SCCOJAG on serous sex hormone concentration of castrated rats(±s)

Tab.2 Influence of SCCOJAG on serous sex hormone concentration of castrated rats(±s)

E2:Estradiol;FSH:Follicle-stimulatinghormone;LH:Luteinizing hormone*P＜0.05,**P＜0.01 vs model group

Group n E2(μ mol/L) FSH(IU/L) LH(IU/L)False operation 10120.36±32.60** 0.25±0.07*0.27±0.08**Model 12 77.55±17.64 0.35±0.16 0.44±0.17 diethylstilbestrol 9 130.36±54.04** 0.06±0.04**0.20±0.07**Large dosage 7 82.73±20.09 0.27±0.06 0.34±0.10 Middle dosage 7 91.31±19.9 10.26±0.07 0.32±0.07*Small dosage 8 129.80±22.35** 0.22±0.07*0.24±0.06**

Tab.3 Influence of SCCOJAG on brain NOS,ChAE,and AChE activity of castrated rats(±s)

Tab.3 Influence of SCCOJAG on brain NOS,ChAE,and AChE activity of castrated rats(±s)

NOS:Nitric oxide synthase;ChAE:Choline acetyltransferase;AChE:Acetylcholinesterase*P＜0.05,**P＜0.01 vs model group

Group n NOS(μ mol/mg pro)ChAE(IU/g)AChE(μ mol/mg pro)False operation 107.45±3.48*225.59±57.63* 0.60±0.24*Model 124.53±2.87 183.24±31.01 0.87±0.35 diethylstilbestrol 9 8.16±4.01*276.31±99.36**0.47±0.23**Large dosage 7 5.34±3.37 201.24±46.28 0.78±0.31 Middle dosage 7 6.82±3.14 237.77±62.54* 0.58±0.22*Small dosage 8 8.76±4.32**256.31±78.05**0.41±0.26**

3 討論

SCCOJAG縮短去勢(shì)大鼠登臺(tái)潛伏期,增加穿越原平臺(tái)次數(shù),提高了去勢(shì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,該作用可能與其顯著升高E2,降低FSH和 LH,增加腦內(nèi) NOS、ChAT活性,降低AChE活性,使腦內(nèi)NO、Ach水平升高。

大鼠去卵巢后由于內(nèi)源性雌激素水平下降,導(dǎo)致NOS神經(jīng)元活性下降,NO合成減少,進(jìn)而影響長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(long-term potentiation,LTP)的形成和突觸可塑性的建立,妨礙正常學(xué)習(xí)記憶行為的獲得;雌激素能增加NOS的表達(dá),刺激NO合成增加[2]。腦內(nèi)Ach水平與學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)呈量效關(guān)系,雌激素可以增加Ach的釋放,增強(qiáng) ChAT的活性[3],抑制AChE的活性,使腦內(nèi)Ach增加,從而增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶。此機(jī)制尚不清楚,SCCOJAG可能通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化或代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に?也可能促進(jìn)卵巢和其他腺體分泌雌激素,或作為植物雌激素而發(fā)揮作用。

SCCOJAG富含的油酸、亞油酸可以生成γ-亞麻酸,二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)及前列腺素和白三烯等;α-亞麻酸進(jìn)入體內(nèi)后主要以二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)形式存在[4]。AA,EPA和DHA為腦發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶功能所必需;AA和DHA能增加Ach的釋放、參與LTP和突觸可塑性的調(diào)節(jié)進(jìn)而提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力;AA也可增加神經(jīng)元葡萄糖的攝取,并促進(jìn)記憶的形成[5];EPA等能增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,而增強(qiáng)LTP、記憶形成與鞏固,因此SCCOJAG能增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶。

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