李寶莉,符兆英,陳雅慧,高 楓,張正祥

(延安大學醫(yī)學院,陜西 延安 716000)

卵巢功能衰退,體內雌激素水平下降致神經內分泌調節(jié)機制失衡而出現一系列癥狀,現代醫(yī)學稱為“圍絕經期綜合征”,主要采用性激素替代療法,但存在諸多禁忌癥和不良反應,臨床應用受到限制。目前尋找具有雌激素樣生物活性的天然藥物是國內外研究的熱點,其中延緩卵巢衰老是研究藥物機理的中心環(huán)節(jié)。本課題采用酸棗仁油、柏子仁油、梔子仁油制備成酸柏梔油軟膠囊,研究其對雌性去勢大鼠學習記憶的影響,初步探討其抗衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雌性SPF級SD大鼠60只,3月齡,體重(280±20)g,由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供,陜醫(yī)動字:08-005。

1.2 實驗藥物

酸柏梔油軟膠囊(soft capsule of compound oil of jujube,arboruitae and gardenia,SCCOJAG)是將酸棗仁油、柏子仁油、梔子油按3∶3∶l配伍,由西安東盛醫(yī)藥研究所制備成每粒 0.5 g,批號:081120。乙烯雌酚(Diethylstilbestrol;石家莊市協(xié)和藥業(yè)有限公司生產,批號:H13021146)。

1.3 實驗器材

KDC-160HR高速冷凍離心機,MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司制造),TU-1800PC紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。E2、FSH、LH測定:采用羅氏COBASE411全自動化學發(fā)光免疫分析儀(電化學免疫發(fā)光法),所用診斷試劑、標準品和質控品均由瑞士羅氏公司提供。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)檢測試劑盒(批號:20080913),乙酰膽堿轉移酶(choline acety ltransferase,ChAT)檢測試劑盒(批號:20080721),膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)檢測試劑盒(批號:20080515)均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 實驗與分組

(1)卵巢去勢組:取50只健康雌性SD大鼠,3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)腹腔注射麻醉,無菌條件下行雙側卵巢切除術,術后立即肌注4×105U青霉素預防感染。隨機分為5組(n=10):SCCOJAG大、中、小劑量組,乙烯雌酚組,模型組。(2)假手術組:開腹后不切除雙側卵巢,僅切除卵巢周圍等體積的脂肪。術后2周,行陰道脫落細胞檢查,確定造模成功。手術4周后開始灌胃給藥,每天1次,連續(xù)12周。大、中、小劑量組分別給予 SCCOJAG 4.50 g/kg 、1.80 g/kg、0.72 g/kg;乙烯雌酚組給予己烯雌酚0.02 mg/kg,模型組和假手術組均給予等體積的生理鹽水作對照。

1.5 Morris水迷宮實驗

第121天于給藥后1 h開始訓練(每天9∶00-12∶00),水溫保持在(22±2)℃。將水池等分為4個象限,在任意象限正中離池壁33 cm處放一個直徑12 cm、高20 cm的平臺,平臺頂低于水面2 cm。實驗前將大鼠置于站臺上適應20 s,隨后將大鼠從不同象限入水點背對站臺放入水池,記錄大鼠自入水到找到站臺所需的時間,記為潛伏期,找到后在平臺上保持15 s,如2 min內找不到,引導到平臺上保持15 s。每天每只大鼠訓練4個象限,連續(xù)訓練5 d。定位航行實驗結束后撤掉平臺,選定和平臺相對的象限中點為入水點,觀察大鼠在120 s內跨越原平臺所在位置的路徑和次數,記錄穿越次數。訓練期間迷宮外參照物保持不變,室內保持安靜。

1.6 血樣的收集與檢測

第126天空腹12 h末次給藥1 h后,3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,頸總動脈導管引流取血,低溫離心分離血清,測定性激素。

1.7 腦組織生化指標測定

(1)組織勻漿制備:取血后,在冰臺上迅速剝離大腦皮層,冷生理鹽水溶液沖洗殘血,拭干。精確稱取腦組織,置超聲波組織勻漿器中粉碎,加入9倍預冷的生理鹽水溶液,制成10%的組織勻漿液待測。(2)測試方法:NOS、ChAE、AChE的測定(比色法)嚴格按試劑說明操作。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件,對水迷宮重復測量數據進行一般線性模型(general linear model,GLM)的 Repeated measures和Multivariate,用 Repeated measures單變量方差分析LSD-t檢驗,實現每組在每個時間點上的兩兩比較;用Multivariate多元方差分析LSD-t檢驗,實現每個時間點上組間的兩兩比較[1]。其它計量資料的方差分析采用Univariate中組間LSD-t檢驗/Tamhane-t′檢驗的兩兩比較。

2 結果

2.1 SCCOJAG對去勢大鼠學習記憶的影響

去勢大鼠的登臺潛伏期較長,穿越原平臺次數較少;SCCOJAG能縮短登臺潛伏期,增加穿越原平臺次數,與模型組比較有統(tǒng)計學意義;各給藥組的潛伏期隨訓練天數增加逐漸縮短也有明顯的統(tǒng)計學意義,作用類似乙烯雌酚組(表1)。

Tab.1 Influence of SCCOJAG on platform-climbing latency and crossing number in Morris water maze of castrated rats(±s)

Tab.1 Influence of SCCOJAG on platform-climbing latency and crossing number in Morris water maze of castrated rats(±s)

SCCOJAG:Soft capsule of compound oil of jujube,arboruitae and gardenia*P＜0.05 vs model group

Group n D1(S) D2(S) D3(S) D4(S) D5(S) Cross No.in min False operation 10 59.75±38.23 43.15±41.98 28.55±37.78 20.74±20.93 15.35±14.14 2.4±1.2 Model 12 73.50±41.13 58.52±39.45 45.54±33.07 34.91±28.27 28.89±22.14 1.6±1.4 Diethylstilbestrol 9 45.39±45.63 32.27±32.65 22.78±25.49 14.11±10.07*12.37±9.05* 2.8±1.6 Large dosage 7 61.78±49.75 48.35±46.03 33.84±35.90 22.47±20.26 18.45±16.17 1.8±1.7 Middle dosage 7 54.00±35.75 34.31±33.81 24.10±34.77 16.63±15.04 14.63±14.14 2.5±1.4 Small dosage 8 36.66±32.82*25.73±20.04*19.06±15.13*12.19±8.27* 10.68±8.40* 3.5±2.3*

2.2 SCCOJAG對去勢大鼠血清雌性激素的影響

去勢大鼠血清雌二醇(Estradiol,E2)減少,卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)和促性腺激素(Luteinizing hormone,LH)增加;SCCOJAG可顯著升高E2,降低FSH和LH,與模型組比較有統(tǒng)計學意義,以小劑量組作用強,作用類似乙烯雌酚組(表2)。

2.3 SCCOJAG對去勢大鼠腦內NOS、ChAE、AChE的影響

去勢大鼠腦內NOS、ChAE活性較低,AChE活性較高;SCCOJAG可增加腦內NOS、ChAE活性,降低AChE活性,與模型組比較有統(tǒng)計學意義,也以小劑量組作用明顯,作用類似乙烯雌酚組(表3)。

Tab.2 Influence of SCCOJAG on serous sex hormone concentration of castrated rats(±s)

Tab.2 Influence of SCCOJAG on serous sex hormone concentration of castrated rats(±s)

E2:Estradiol;FSH:Follicle-stimulatinghormone;LH:Luteinizing hormone*P＜0.05,**P＜0.01 vs model group

Group n E2(μ mol/L) FSH(IU/L) LH(IU/L)False operation 10120.36±32.60** 0.25±0.07*0.27±0.08**Model 12 77.55±17.64 0.35±0.16 0.44±0.17 diethylstilbestrol 9 130.36±54.04** 0.06±0.04**0.20±0.07**Large dosage 7 82.73±20.09 0.27±0.06 0.34±0.10 Middle dosage 7 91.31±19.9 10.26±0.07 0.32±0.07*Small dosage 8 129.80±22.35** 0.22±0.07*0.24±0.06**

Tab.3 Influence of SCCOJAG on brain NOS,ChAE,and AChE activity of castrated rats(±s)

Tab.3 Influence of SCCOJAG on brain NOS,ChAE,and AChE activity of castrated rats(±s)

NOS:Nitric oxide synthase;ChAE:Choline acetyltransferase;AChE:Acetylcholinesterase*P＜0.05,**P＜0.01 vs model group

Group n NOS(μ mol/mg pro)ChAE(IU/g)AChE(μ mol/mg pro)False operation 107.45±3.48*225.59±57.63* 0.60±0.24*Model 124.53±2.87 183.24±31.01 0.87±0.35 diethylstilbestrol 9 8.16±4.01*276.31±99.36**0.47±0.23**Large dosage 7 5.34±3.37 201.24±46.28 0.78±0.31 Middle dosage 7 6.82±3.14 237.77±62.54* 0.58±0.22*Small dosage 8 8.76±4.32**256.31±78.05**0.41±0.26**

3 討論

SCCOJAG縮短去勢大鼠登臺潛伏期,增加穿越原平臺次數,提高了去勢大鼠的學習記憶能力,該作用可能與其顯著升高E2,降低FSH和 LH,增加腦內 NOS、ChAT活性,降低AChE活性,使腦內NO、Ach水平升高。

大鼠去卵巢后由于內源性雌激素水平下降,導致NOS神經元活性下降,NO合成減少,進而影響長時程增強效應(long-term potentiation,LTP)的形成和突觸可塑性的建立,妨礙正常學習記憶行為的獲得;雌激素能增加NOS的表達,刺激NO合成增加[2]。腦內Ach水平與學習記憶的增強呈量效關系,雌激素可以增加Ach的釋放,增強 ChAT的活性[3],抑制AChE的活性,使腦內Ach增加,從而增強學習記憶。此機制尚不清楚,SCCOJAG可能通過體內轉化或代謝轉變?yōu)榇萍に?也可能促進卵巢和其他腺體分泌雌激素,或作為植物雌激素而發(fā)揮作用。

SCCOJAG富含的油酸、亞油酸可以生成γ-亞麻酸,二高-γ-亞麻酸、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)及前列腺素和白三烯等;α-亞麻酸進入體內后主要以二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)形式存在[4]。AA,EPA和DHA為腦發(fā)育和學習記憶功能所必需;AA和DHA能增加Ach的釋放、參與LTP和突觸可塑性的調節(jié)進而提高實驗動物的學習能力;AA也可增加神經元葡萄糖的攝取,并促進記憶的形成[5];EPA等能增加細胞內Ca2+濃度,而增強LTP、記憶形成與鞏固,因此SCCOJAG能增強學習記憶。

[1]邱 宏,金國琴,金如鋒,等.水迷宮重復測量數據的方差分析及其在SPSS中的實現[J].中西醫(yī)結合學報,2007,5(1):101-105.

[2]Kii N,Adaehi N,Liu K,et al.Acute effects of 17 betaestradiol on oxidative stress in ischemic rat striatum[J].J Neurosurg Anesthesiol,2005,17(1):27-32.

[3]Horvath K M,Hartig W,Van der Veen R,et al.17 betaestradiol enhances cortical cholinergic innervation and preserves synaptic density following excitotoxic lesions to the rat nucleus basalis magnocellularis[J].Neurosci,2002,110(3):489-504.

[4]李寶莉,朱 梅,符兆英,等.酸柏梔油軟膠囊對小鼠鎮(zhèn)靜催眠促學習記憶作用的影響[J].中國老年學雜志,2012,32(8):1639-1642.

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