劉可云,朱 毅,黃賢珍

(1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,恩施 445000;2.海南省藥品檢驗所,?？?570216;3.湖北省恩施州中心醫(yī)院腎內(nèi)科,恩施 445000)

水黃皮 Pongamia pinnata(L.)Merr.(異名Pongamia glabra)為豆科(Leguminosae)水黃皮屬(Pongamia Vent.)的半紅樹植物,別名水流豆,廣泛分布于印度、馬來西亞及我國南部的廣東、廣西、海南。在印度,其種子和種子油用來治療白斑病、麻風(fēng)病、腰部風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)風(fēng)濕病,葉子用于治療痔瘡、腫瘤、傷口消炎等病癥[1]。前期動物研究證實水黃皮根總黃酮(pongamia pinnata root flavonoids,PRF)具有明顯的抗大鼠實驗性胃潰瘍作用[2]。本實驗擬通過研究水黃皮根總黃酮對乙酸型胃潰瘍大鼠表皮生長因子(epidermal growth factor-α,EGF)及轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α)表達的影響 ,從分子水平探討該藥促進潰瘍愈合的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠,雌雄兼用,體重180～200g,由廣東省實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(粵)2002-0002。在SPF級動物房內(nèi),恒溫(20±2)℃,濕度55%～65%,光照、黑暗各12 h交替,中央空調(diào)集中通風(fēng)每小時8～15次條件下飼養(yǎng)。喂養(yǎng)標準飼料,飲用水為過濾除菌后的城市自來水。

1.1.2 藥物與試劑 水黃皮根,2006年3月采于海南省海口市,由海南省藥品檢驗所中藥室陳國彪主任藥師鑒定為Pongamia pinnata(L.)Merr的根莖。水黃皮根總黃酮由海南省藥品檢驗所中藥室提供,通過成分鑒定和含量分析,總黃酮純度＞65%。西咪替丁片劑(Cimetiding,Cim),購自海南制藥廠有限公司,批號:050701。以上藥品均用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制為混懸液。大鼠EGF放免試劑盒,由中國原子能科學(xué)研究所提供,批號:200611。兔抗大鼠EGF、TGF-α均由武漢博士德生物工程公司提供。SP試劑盒和DAB顯色試劑盒由北京中杉金橋公司提供,批號分別為:52282108和66286185。

1.1.3 主要儀器 K15低溫離心機,美國Sigma公司;SN-69T放免γ計數(shù)器,上海原子核研究所日環(huán)儀器廠;HM340石蠟切片機,德國萊卡公司;BX50顯微鏡,日本奧林巴斯;HMIAS-2000醫(yī)學(xué)病理分析系統(tǒng),同濟醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司。

1.2 動物模型制備

參照文獻[3]方法,除正常組外各組大鼠禁食24 h,用3%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)腹腔注射麻醉,常規(guī)消毒,自劍突向下沿腹中線剪開約2 cm,自肝臟后找出胃,將胃移出腹腔,用微量注射器將0.02 ml 30%的乙酸(假手術(shù)組注射等體積生理鹽水)注射至胃竇部前壁漿膜下近肌層處,待出現(xiàn)直徑約3 mm半透明的白斑后,將胃送還腹腔,以大網(wǎng)膜包裹,縫合腹膜、肌層和皮膚。

1.3 動物分組和給藥

大鼠隨機分為6組,即正常組、模型組、PRF(50、150和450 mg/kg)組、西咪替丁組 140 mg/kg組,每組8只。造模3 d后,PRF組和西咪替丁組按照劑量灌胃給藥,灌胃體積為10 ml/kg,正常組和模型組均灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液,每日一次,共14 d。

1.4 標本采集和處理

治療14 d后,大鼠禁食不禁水24 h,用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,摘眼球取血2～3 ml,3 000 r/min離心10 min,分離血清,置于EP管中,-20℃冰箱保存,待測EGF。破腹,在距賁門和幽門1.5 cm處結(jié)扎、離斷,取出全胃。胃內(nèi)注射8 ml含0.1%DEPC的4%多聚甲醛,并全胃置于0.1%DEPC的4%多聚甲醛中固定20 min后,沿胃大彎剪開,冰生理鹽水沖洗,濾紙吸干后鋪開,以游標卡尺測定潰瘍最大長徑及垂直于最大長徑的最大寬徑。然后將胃置于含0.1%DEPC的4%多聚甲醛繼續(xù)固定12 h,以平行與胃潰瘍長軸方向的最長徑為中心取材,按常規(guī)脫水,石蠟包埋,并以潰瘍灶或潰瘍疤痕的最長徑為中心5 μ m厚度連續(xù)切片,行HE染色和EFF、TGF-α的免疫組化顯色。

1.5 觀察指標

1.5.1 胃粘膜大體觀察 觀察胃竇部潰瘍的大小、深淺、基底清潔度,有無覆白苔,周圍粘膜色澤及充血水腫等情況。同時按照文獻[4]方法計算潰瘍指數(shù)(Ulcer Index,UI)=潰瘍最大長徑 垂直于最大長徑的最大寬徑。并按公式(1-實驗各組潰瘍指數(shù)均值/模型組潰瘍指數(shù)均值)100%計算潰瘍抑制率。

1.5.2 血清EGF水平測定 自-20℃冰箱取出血清,按照試劑盒說明書以放免法測定血清EGF,以pg/ml表示。

1.5.3 免疫組化及原位雜交顯色 應(yīng)用免疫組化SP法檢測大鼠胃黏膜EGF、TGF-α表達水平。以PBS替代一抗作為陰性對照,以人乳腺癌標本作為陽性對照。以胞膜或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為顯色陽性。具體操作參照說明書進行。應(yīng)用計算機圖像分析系統(tǒng),在光學(xué)顯微鏡×400倍下,選取5個視野 ,以象素點長 0.389 μ m,154.6 μ m ×115.5 μ m 測量窗下測量陽性細胞面積百分比及其平均積分光密度,取均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件,所有實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差(±s)表示,不同組間比較采用單因素方差分析,與對照組比較采用dunnet-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PRF對大鼠乙酸型胃潰瘍胃黏膜潰瘍指數(shù)的影響

除正常組外各組大鼠腺胃小彎側(cè)黏膜均可見一潰瘍。模型組的大鼠潰瘍面積大,其上被覆白苔,潰瘍底較污穢,周圍黏膜環(huán)堤樣水腫隆起;PRF中、高劑量組及Cim組的大鼠潰瘍面積較小且較表淺,潰瘍基底普遍色紅,覆淺白苔,周邊黏膜輕度水腫。計算潰瘍UI和潰瘍抑制率發(fā)現(xiàn),PRF中、高劑量組及Cim組UI明顯低于模型組(P＜0.01),低劑量組UI也低于模型組但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與西咪替丁組相比,PRF大劑量組UI明顯降低(P＜0.05),而中劑量沒有明顯差異(P＞0.05),但是PRF低劑量組UI明顯大于Cim組(P＜0.05,表1)。

2.2 PRF對乙酸型胃潰瘍大鼠血清EGF水平的影響

與正常組比較,模型組血清EGF含量顯著增高(P＜0.05);與模型組比較,PRF中、高劑量組和Cim組血清EGF含量明顯增高(P＜0.05,P＜0.01);與西咪替丁組比較,PFR高劑量組EGF含量明顯增高(P＜0.05),而中劑量組EGF未見明顯變化(P＞0.05),但西咪替丁組明顯高于PRF低劑量組(P＜0.05,表 1)。

Tab.1 Effects of PRF on Ulcer Index and contents of EGF in blood serum in rats(±s,n=8)

Tab.1 Effects of PRF on Ulcer Index and contents of EGF in blood serum in rats(±s,n=8)

PRF:Pongamia pinnata root flavonids;Cim:Cimetiding**P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs model group;△P＜0.05 vs Cim group

Group Dose(mg/kg) Ulcer Index The ulcer inhibition rate/%The contents of EGF in blood serum(pg/ml)Normal - - - 552.21±76.91 Model - 27.32±5.27* - 623.72±81.10*PRF 50 20.13±3.76 26.32 629.56±89.04 150 15.86±3.19**## 41.98.56 711.07±80.15**#450 5.83±2.46**##△ 78.66 728.94±106.55**#△Cim 140 12.33±4.05**## 54.87 656.25±87.17**#

2.3 PRF對大鼠乙酸型胃潰瘍胃黏膜EGF表達的影響

正常組的大鼠EGF的表達為弱陽性,定位于胞漿,主要集中在胃腺頸部,陽性表達細胞以胃黏膜壁細胞、頸部細胞為主。與正常組比較,模型組、Cim組和PRF各劑量組潰瘍邊緣組織陽性表達明顯增強(P＜0.01)。與模型組比較,PRF中、高劑量組和Cim組表達均顯著增加(P＜0.05,P＜0.01)。與Cim組比較,PRF低劑量組EGF表達明顯低于Cim組(P＜0.05),PRF中劑量組EGF表達與Cim組沒有顯著性差異(P＞0.05),而PRF高劑量組潰瘍邊緣胃黏膜EGF表達則顯著強于Cim組(P＜0.05,圖1,表 2)。

Tab.2 Effects of PRF on EGF expression of gastric ulcer induced by acetic acid(±s,n=8)

Tab.2 Effects of PRF on EGF expression of gastric ulcer induced by acetic acid(±s,n=8)

PRF:Pongamia pinnata root flauonoids;Cim:Cimetiding**P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs control group;△P＜0.05 vs Cim group

Group Dose(mg/kg)Percentage of acreage(%)Integral optic density Normal- 5.82±1.30 0.59±0.21 Model - 13.01±4.03** 1.47±0.34**PRF 50 17.57±3.69** 1.92±0.63**150 24.68±4.11**## 3.25±0.84**##450 27.98±4.30**##△ 3.73±1.23**##△Cim 140 20.45±5.24**# 2.48±0.81**##

Fig.1 Effects of PRF on EGF expression of gastric ulcer induced by acetic acid in rats(DAB×400)

2.4 PRF對大鼠乙酸型胃潰瘍胃黏膜TGF-α表達的影響

正常組的大鼠TGF-α的表達為弱陽性,定位于胞漿,主要集中在胃腺頸部、基底部,陽性表達細胞以胃黏膜壁細胞、頸部細胞為主。與正常組比較,模型組、Cim組和PRF各劑量組潰瘍邊緣組織陽性細胞表達積分光密度明顯增強和陽性細胞面積百分比明顯增多(P＜0.01)。與模型組比較,PRF中、高劑量組和Cim組陽性細胞表達積分光密度和陽性細胞面積百分比表達均顯著升高(P＜0.01),PRF低劑量組陽性細胞表達積分光密度顯著增強陽性細胞表達積分光密度,而陽性細胞面積百分比沒有明顯差異(P＞0.05)。與Cim組比較,PRF低劑量組TGF-α表達明顯低于Cim組(P＜0.05),PRF中劑量組TGF-α表達與Cim組沒有顯著性差異(P＞0.05),而PRF高劑量組潰瘍邊緣胃黏膜TGF-α表達則顯著高于Cim 組(P＜0.05,表3)。

Tab.3 Effects of PRF on TGF-αexpression of gastric ulcer induced by acetic acid in rats(±s,n=8)

Tab.3 Effects of PRF on TGF-αexpression of gastric ulcer induced by acetic acid in rats(±s,n=8)

PRF:Pongamia pinnata root flavonoids;Cim:Cimetiding**P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs Cim group

Group Dose(mg/kg)Percentage of acreage(%)Integral optic density Normal- 8.73±2.81 0.71±0.22 Model- 15.13±3.94** 1.59±0.26**PRF 50 18.65±4.67**# 1.85±0.43**150 25.52±5.02**## 2.51±0.65**##450 28.68±6.07**##△△3.09±0.95**##△Cim 140 24.79±4.98**## 2.61±0.78**#

3 討論

由于乙酸型大鼠胃潰瘍模型具有形態(tài)類似于臨床胃潰瘍,病變持續(xù)時間長,其修復(fù)過程與人的胃潰瘍類似[5],因此比較適合于藥物治療胃潰瘍的療效評價,以及藥理作用機制的研究。對實驗性潰瘍愈合過程的研究表明[6],不管潰瘍成因如何,一旦潰瘍形成,其修復(fù)及愈合都經(jīng)歷共同相似的過程。壞死物的清除,潰瘍底部的肉芽組織形成,進而形成纖維組織和瘢痕組織。潰瘍邊緣的粘膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,腺體呈囊狀擴張且頂端向潰瘍底部凹陷,形成一“過渡帶”。在生長因子的作用下,潰瘍邊緣的粘膜上皮增生、分化并向潰瘍中心移行,逐漸以單層上皮覆蓋潰瘍底部;擴張的腺體及再生的上皮細胞逐漸形成管狀結(jié)構(gòu),分化腺體,最終形成正常成熟的腺體。胃潰瘍的愈合是一個非常復(fù)雜的過程,包括細胞移行、分化、增殖和細胞基質(zhì)形成及新生血管生成等,多個細胞因子參與了這一過程。

EGF是主要存在于頜下腺、十二指腸Brunner腺頜胰腺中,是一種含有53個氨基酸的單鏈多肽[7]?，F(xiàn)已證實EGF是一種具有抑制胃酸分泌、促進上皮細胞增殖,組織修復(fù)及細胞保護作用的內(nèi)源性物質(zhì),在保護胃粘膜免受損傷因子破壞、維持胃腸粘膜完整性方面起到非常重要的作用。在小鼠實驗性胃潰瘍模型中,在潰瘍發(fā)生的第2～4天,即有EGFRmRNA表達,4天后有EGF過度表達。大鼠乙酸胃潰瘍自愈過程中,EGF、TGF-α、EGFR的表達發(fā)生規(guī)律性的變化,潰瘍邊緣組織表達比正常組明顯增高,壞死組織無表達,肉芽組織、瘢痕組織少有表達,潰瘍的早期表達不明顯,潰瘍的愈合期則表達明顯[8]。

EGFR是一具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,分子量為170 000,主要分布在胃壁、十二指腸和小腸粘膜上,有 EGF 、TGF-α兩種配體,對 EGF、TGF-α有高度親和力,對其誘導(dǎo)產(chǎn)生變構(gòu),形成受體二聚體,激活受體膜內(nèi)區(qū)域的酪氨酸蛋白激酶,使自身的一系列酪氨酸被磷酸化,通過Grb2和Sos最終激活P21ras而傳導(dǎo)信號,調(diào)節(jié)細胞生長與分化[9]。

TGF-α是EGF家族中的另一參與胃粘膜損傷后修復(fù)的主要調(diào)節(jié)肽,產(chǎn)生于整個胃腸道,尤以胃竇部粘膜表達量高,TGF-α具有對多種細胞促有絲分裂作用,如上皮細胞、內(nèi)皮細胞、纖維組織和粘膜組織等。在胃腸道TGF-α參與調(diào)節(jié)粘膜上皮的更新和粘膜損傷后的修復(fù),是維持粘膜完整性的重要介質(zhì),被稱為“粘膜完整肽”[7]。壁細胞膜表面有其受體,提示TGF-α通過自分泌的形式調(diào)節(jié)壁細胞的泌酸功能[10]。

本研究通過放免法、免疫組化法,探討了PRF對大鼠乙酸燒灼型胃潰瘍胃粘膜組織EGF、TGF-α表達的影響。在治療14 d后,模型組大鼠 EGF、TGF-α的表達較正常組強,EGF、TGF-α、定位于胞漿,主要集中在潰瘍邊緣組織的胃腺頸部及基底部的壁細胞、頸部細胞。與文獻報道一致[7]。胃腺頸部及基底部是胃粘膜上皮細胞增殖的部位。因此提示,PRF組能顯著增加潰瘍邊緣組織EGF、TGF-α表達。提示PRF可能通過促進潰瘍邊緣粘膜組織細胞的分化、增殖來促進潰瘍的修復(fù)和愈合。EGFR的增加除了介導(dǎo)粘膜上皮的分裂、增殖外,還介導(dǎo)抑制胃酸的分泌,是胃潰瘍組織修復(fù)過程中的主要環(huán)節(jié)。據(jù)報道[10]當(dāng)血液循環(huán)中的EGF與該受體結(jié)合后,可抑制胃酸的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)PRF能明顯抑制胃酸的分泌;能顯著提高血清中EGF的含量。提示PRF可能通過增加血液中EGF含量,提高胃粘膜組織EGF表達,抑制胃酸的分泌、促進潰瘍的愈合。

由此推測PRF促進乙酸燒灼型潰瘍愈合可能與促進潰瘍邊緣組織EGF、TGF-α的表達,刺激潰瘍邊緣“愈合帶”上皮細胞增殖、分化和移行,增加胃粘膜的血流量,改善微循環(huán),抑制胃酸的分泌有關(guān)。

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