張玉芹,田衛(wèi)華,彭 芳,徐 珍,聶永莉

(武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,湖北 武漢 430065)

鎘是一種存在于自然界并在工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的重金屬,主要來(lái)源于冶煉、電鍍、染料、蓄電池、采礦等行業(yè)中。鎘也是一種有毒的重金屬,它可污染環(huán)境和水體,是目前倍受關(guān)注的環(huán)境污染物。過量的鎘進(jìn)入體內(nèi),會(huì)對(duì)許多組織器官產(chǎn)生毒性作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)資料表明,鎘具有神經(jīng)毒性,它能破壞血-腦屏障,進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起大腦的形態(tài)和功能改變[1]。鎘還對(duì)腎和生殖系統(tǒng)有很強(qiáng)的毒性。環(huán)境中的鎘對(duì)人體的潛在危害越來(lái)越引起人們的重視。然而,關(guān)于鎘的毒性作用機(jī)制雖然有很多學(xué)說(shuō),但迄今為止確切機(jī)制并不清楚。其中一種學(xué)說(shuō)認(rèn)為,鎘影響細(xì)胞膜的某些受體或通道,從而改變膜受體、通道的功能和信號(hào)傳遞而產(chǎn)生毒性作用[2]。嘌呤受體(purinoceptor,P)分為P1受體和P2受體,P1為腺苷受體,P2為ATP受體。ATP受體又分為離子通道型受體(P2X)和G蛋白偶聯(lián)受體(P2Y)兩種亞型。P2X4屬于離子通道型ATP受體超家族成員(P2X1～P2X7)之一,它廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,還分布于胰腺、膽管、泌尿器官、生殖器官、消化管以及呼吸道等,是中樞及外周組織表達(dá)最為豐富的P2X受體之一[3]。細(xì)胞外的ATP與 P2X4受體(或通道)結(jié)合,發(fā)揮介導(dǎo)快速興奮傳遞的作用。然而,鎘中毒時(shí)是否有P2X4受體參與?目前還未見有關(guān)報(bào)道。鎘對(duì)P2X4受體功能有無(wú)影響?影響的特征和機(jī)制如何?本實(shí)驗(yàn)用非洲爪蟾卵母細(xì)胞作為異體表達(dá)P2X4受體的載體,以P2X4受體介導(dǎo)的ATP-激活電流(IATP)為觀察指標(biāo),應(yīng)用雙極電壓鉗技術(shù),研究鎘對(duì)P2X4受體介導(dǎo)的ATP-激活電流的影響及其特征,以了解鎘的毒性作用是否與膜受體/通道有關(guān),為鎘中毒的防治尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、重組質(zhì)粒、藥品及試劑

成熟雌性非洲爪蟾(中國(guó)科學(xué)院生物遺傳與發(fā)育研究所提供)。大鼠頸上神經(jīng)節(jié)重組質(zhì)粒pcDNA3-P2X4由Dr.G.Buell(Glaxo Insititute for Molecular Biology)構(gòu)建。內(nèi)切酶Xho I(Fermentas公司);體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Mmessage Mmachine T7 RNA Transcription Kit,Ambion公司);ATPNa2(Sigma公司);氯化鎘(Merk公司,德國(guó));OR2溶液(mmol/L):NaCl 82.5,KCl 2.0,MgCl2·6H2O 1.0,HEPES 5.0,使用時(shí) ,用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4～7.6,過濾后使用;卵母細(xì)胞孵育液(mmol/L):NaCl 96.0、KCl 2.0、Mg Cl2·6H2O 1.0 、CaCl21.8、HEPES 5.0,調(diào)節(jié) pH 至7.4～7.6,使用前高壓滅菌,并加青霉素至100 U/L和丙酮酸鈉2 mmol/L。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

雙極電壓鉗放大器(OC-725C,美國(guó)Warner公司);微量注射儀(Micro4TM Nanoliter2000,美國(guó)WPI公司);微電極拉制儀(德國(guó)HEKA公司);8道灌流系統(tǒng)(ALA-VM8,Scientific Instruments,NY);微操縱器(美國(guó)WPI);Biophotometer核酸測(cè)定儀(Eppendorf公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(Gene公司)。

1.3 cRNA的體外轉(zhuǎn)錄及爪蟾卵母細(xì)胞顯微注射

CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)菌,將P2X4受體的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α中擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、純化、線性化,以線性化的DNA為模板,體外轉(zhuǎn)錄成cRNA。用無(wú)酶水將cRNA濃度調(diào)至1 ng/nl,放置-70℃冰箱備用。取成熟雌性爪蟾,冰浴麻醉,手術(shù)取卵,在無(wú)Ca2+的Ringers'液中加入1 g/L膠原酶進(jìn)行消化,以去除卵母細(xì)胞的濾泡膜及血管膜。將卵母細(xì)胞置于孵育液中,在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7 h,將體cRNA注射到爪蟾卵母細(xì)胞的胞漿中,每個(gè)細(xì)胞注射40 nl～50 nl(濃度為1 ng/nl)。設(shè)空白對(duì)照組和注射等量三蒸水的對(duì)照組。在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用于電生理研究。

1.4 電生理記錄

將注射P2X4受體cRNA的卵母細(xì)胞置于細(xì)胞池中,用Ringers'液以2 ml/min的速度灌流,電壓電極和電流電極分別充灌0.15 mol/L和3 mol/L的KCl溶液,按照我們研究室以前的方法[4]測(cè)出實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的靜息電位,膜電位鉗制為-60 mV。電流電極所記錄的信號(hào)經(jīng)過放大、轉(zhuǎn)換,輸入計(jì)算機(jī)采樣和存儲(chǔ),并通過計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。用CytoBench軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采樣、存儲(chǔ)和分析。實(shí)驗(yàn)所用的液體均在使用前臨時(shí)配制。ATP、CdCl2等均用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液配制,并將pH調(diào)至7.4～7.6。ATP和鎘均通過8通道加藥系統(tǒng)給藥,給藥時(shí)間為20 s,加藥時(shí)間間隔為6 min。量-效關(guān)系曲線采用Hill方程進(jìn)行擬合,I/Imax=1/(1+(EC50/C)n),I/Imax表示當(dāng)前效應(yīng)和最大效應(yīng)百分比,EC50為半效能作用濃度,C為激活物濃度,n為Hill系數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理及圖表的繪制采用Sigmaplot軟件。

2 結(jié)果

2.1 爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的P2X4受體介導(dǎo)的ATP-激活電流

在-60mV的鉗制電位下,依次用含有1 μ mol/L、3 μ mol/L 、10 μ mol/L 、30 μ mol/L 、100 μ mol/L 、300 μ mol/L ATP的Ringers'液灌流卵母細(xì)胞,均可記錄到不同幅值的ATP-激活電流。隨著ATP濃度的增加,ATP-激活電流也隨之增大,呈濃度依賴性,300 μ mol/L ATP 誘導(dǎo)的 ATP-激活電流與高于 300 μ mol/L的ATP誘導(dǎo)的電流幅度并無(wú)顯著性差異(配對(duì)t檢驗(yàn),P＞0.25,n=5),飽和濃度為 300 μ mol/L(圖1)。在注射等量三蒸水和未注射cRNA的空白對(duì)照組的卵母細(xì)胞,應(yīng)用同樣濃度的ATP,未誘導(dǎo)出電流。分別用含10 μ mol/L去甲腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺的Ringers'液灌流,也未記錄到任何電流,表明外加ATP所誘發(fā)的電流就是表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞中P2X4受體激活所引起的。

2.2 鎘對(duì)爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的P2X4受體介導(dǎo)的ATP-激活電流的影響

用含不同濃度的鎘和1 μ mATP的Ringers'液灌流細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)鎘的濃度從0.1～ 30 μ mol/L,ATP-激活電流幅度可隨鎘濃度的增加而增大,當(dāng)達(dá)到30 μ mol/L時(shí),增強(qiáng)作用達(dá)最大,繼續(xù)增加鎘的濃度時(shí),ATP-激活電流幅度不再增加反而減小(圖2)。單獨(dú)應(yīng)用含不同濃度的鎘的Ringers'液灌流細(xì)胞不能誘發(fā)任何電流。

Fig.1 ATP-activated currents mediated by P2X4 receptor expressed in oocytes(Eh:-60mV)

Fig.2 Effect of cadmium of different concentrations on ATP-activated current mediated by P2X4 receptors expressed in xenopus oocytes

2.3 鎘對(duì)P2X4受體介導(dǎo)的ATP-激活電流量-效曲線的影響

以1 μ mol ATP誘發(fā)的ATP-激活電流為對(duì)照,觀察 10 μ mol/L鎘對(duì)ATP-激活電流的影響,結(jié)果表明,鎘可明顯增強(qiáng)P2X4受體介導(dǎo)的ATP-激活電流,這種增強(qiáng)作用是可逆的,在同一個(gè)細(xì)胞,用Ringers'液沖洗去除鎘的作用后,ATP-激活電流即可恢復(fù)到對(duì)照水平(圖3A)。細(xì)胞外應(yīng)用不同濃度的ATP,記錄ATP-激活電流,繪出ATP濃度-反應(yīng)曲線,然后將每一種濃度的ATP和10 μ mol/L的鎘共同灌流細(xì)胞,可使ATP的量-效曲線明顯左上移。圖3 B顯示的是有鎘和無(wú)鎘時(shí)ATP的濃度-反應(yīng)曲線。在鎘的作用下,ATP-激活電流的 EC50從(17.1±1.5)μ mol/L降低到(9.8±1.8)μ mol/L(P＜0.01),Hill系數(shù)從1.14±0.13上升到1.57±0.36。但ATP-激活電流的最大值沒有因?yàn)殒k的作用而發(fā)生改變。

Fig.3 Effect of cadmium on magnifying ATP-activated currents mediated by P2X4 receptors

2.4 不同鉗制電位下鎘對(duì)P2X4受體介導(dǎo)的ATP-激活電流的影響

當(dāng)ATP 濃度為 10 μ mol/L時(shí) ,改變鉗制電位 ,觀察10 μ mol/L鎘對(duì)ATP-激活電流的影響。鉗制電位分別為-140 mV,-100 mV,-60 mV,-20 mV,20 mV,60mV時(shí),鎘對(duì)ATP-激活電流的增強(qiáng)作用并無(wú)顯著性(ANOVA,P＞0.25,n=10,圖4),表明鎘對(duì)ATP-激活電流的增強(qiáng)作用并無(wú)電壓依賴性。

2.5 鎘孵育時(shí)間不同對(duì)P2X4受體介導(dǎo)的ATP-激活電流的影響

用10 μ mol/L的鎘分別孵育爪蟾卵母細(xì)胞20 s,60 s,120 s,180 s,300 s,再分別加入 1 μ mol/L ATP,觀察預(yù)加鎘孵育時(shí)間不同對(duì)ATP-激活電流的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,預(yù)加鎘的作用時(shí)間在120 s左右,可使ATP-激活電流增強(qiáng)作用達(dá)到最大值(圖5),鎘的孵育時(shí)間為120 s,180 s和300 s時(shí),鎘對(duì)ATP-激活電流增強(qiáng)作用在組間比較并無(wú)顯著性差異(n=5)。

Fig.4 Effects of cadmium on ATP-activated currents meditated by P2X4 receptors at different membrane potentials

Fig.5 Effects of cadmium on magnifying ATP-activated current with different pre-incubation times

3 討論

非洲爪蟾卵母細(xì)胞是一種應(yīng)用最早、表達(dá)功能強(qiáng)大、適用范圍廣的基因表達(dá)體系之一。早期主要用它來(lái)表達(dá)珠蛋白、球蛋白、各種病毒蛋白等,后來(lái),發(fā)現(xiàn)不同類型的離子通道和受體蛋白也可在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)。這種細(xì)胞不僅能有效和精確地翻譯外來(lái)的RNA,還能完成翻譯后的加工,如糖基化、磷酸化、蛋白裂解和向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)等步驟,最終使表達(dá)的蛋白質(zhì)顯示一定的功能。爪蟾卵母細(xì)胞經(jīng)膠原酶消化后,去除濾泡膜和血管膜,用它表達(dá)P2X4受體,可避免內(nèi)源性的嘌呤受體及其它受體的干擾,為專門研究所表達(dá)的受體(或通道)提供了良好的模型。P2X4受體廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中,參與興奮性突觸傳遞過程,同時(shí)還分布于多種組織器官,如消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等。P2X4受體是中樞及外周組織表達(dá)最為豐富的P2X受體之一。我們應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),將體外轉(zhuǎn)錄獲得的P2X4受體的cRNA注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,P2X4受體能高效穩(wěn)定的表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞,注射后存活的細(xì)胞表達(dá)成功的機(jī)率達(dá)到70%以上,并可耐受電生理實(shí)驗(yàn)中的多次加藥以及反復(fù)灌流。

對(duì)于注射P2X4受體cRNA的爪蟾卵母細(xì)胞,細(xì)胞外施加一定濃度的ATP,可誘發(fā)明顯的內(nèi)向電流,(即ATP-激活電流IATP)并顯示濃度依賴性(圖1)。而在注射等量三蒸水和空白對(duì)照組的卵母細(xì)胞,用同樣濃度ATP的Ringers'液灌流時(shí),未誘導(dǎo)出電流。目前尚無(wú)特異性的P2X4受體拮抗劑,為了解爪蟾卵母細(xì)胞是否還存在其它受體干擾IATP,分別用含10 μ mol/L 去甲腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺的Ringers'液灌流,也未誘發(fā)出電流。進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)中所誘發(fā)的卵母細(xì)胞IATP是P2X4受體激活介導(dǎo)的。

細(xì)胞外的ATP是P2X4受體的內(nèi)源性激活物。從圖1可以看出,ATP的濃度在一定范圍內(nèi),隨著ATP的濃度的增加,IATP的幅值也隨之增大。P2X4受體介導(dǎo)的IATP表現(xiàn)出較快的激活和緩慢失活的特性,兩者的時(shí)間常數(shù)均為秒級(jí)水平,遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于之前本研究室在大鼠三叉神經(jīng)節(jié)檢測(cè)到的IATP激活相和失活相時(shí)間常數(shù)的毫秒級(jí)水平[5,6]。當(dāng)用含有1 μ mol/L的ATP和10 μ mol/L鎘的Ringers'液灌流同一細(xì)胞時(shí),可使IATP明顯增強(qiáng),這種增強(qiáng)作用表現(xiàn)為可逆性,因?yàn)樵谌コk的作用后,P2X4受體/通道能很快恢復(fù)至備用狀態(tài)。在未注射和已注射 P2X4受體cRNA的卵母細(xì)胞,單獨(dú)加入鎘未記錄到任何電流。表明鎘不能單獨(dú)誘發(fā)電流。我們推測(cè),鎘對(duì)IATP的影響是通過作用于P2X4受體的胞外的結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的。為了證明我們的推測(cè),實(shí)驗(yàn)中,預(yù)加不同濃度的鎘,再用含有ATP的Ringers'液灌流卵母細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著鎘的濃度增加,IATP的幅度也呈明顯增強(qiáng)效應(yīng),當(dāng)鎘超過一定濃度(30 μ mol/L)時(shí),IATP的幅度不再隨鎘的濃度增加而增加,鎘增強(qiáng)IATP的作用反而減弱(圖 2)。另外,我們還發(fā)現(xiàn),鎘對(duì)IATP的作用無(wú)電壓依賴性(圖4),在不同的鉗制電位下,鎘對(duì)IATP增強(qiáng)作用并無(wú)顯著性差異。由此可以認(rèn)為,鎘的作用位點(diǎn)不是在P2X4通道內(nèi)部,而是位通道外面,可能是與位于細(xì)胞外的位點(diǎn)相結(jié)合,通過對(duì)P2X4受體的變構(gòu)作用實(shí)現(xiàn)的。為了證明這一假設(shè),我們觀察了鎘對(duì)ATP-激活電流量-效曲線的影響,一定濃度的鎘,可使ATP-激活電流量-效曲線向左上移位(圖3B),EC50值接近減半。鎘對(duì)IATP的增強(qiáng)作用類似增加ATP的濃度,而不改變飽和濃度的IATP的最大幅值,表明鎘不是P2X通道的開放劑,而是通過對(duì)受體的變構(gòu),增加該受體與ATP的親和力而發(fā)揮作用。

已有研究表明,P2X4受體在胞外至少有2個(gè)以上相對(duì)獨(dú)立的金屬離子調(diào)制位點(diǎn),已知Zn2+是內(nèi)源性的調(diào)制物,作用于P2X4受體/通道兩個(gè)跨膜域(TM1和TM2)的胞外環(huán)的易化位點(diǎn)上,鎘對(duì)P2X4受體的作用和鋅的作用很相似,推測(cè)低濃度的鎘通過與P2X4受體胞外的易化通道的位點(diǎn)優(yōu)先結(jié)合,通過變構(gòu)作用增強(qiáng)ATP與P2X4受體的親和力,從而增強(qiáng)IATP。為什么鎘的濃度超過30 μ mol/L(中毒濃度)對(duì)IATP產(chǎn)生抑制作用?在通道的胞外環(huán)是否存在抑制性位點(diǎn)?我們推測(cè),鎘的濃度低于30 μ mol/L時(shí),它們可能和P2X4受體的特異性或者敏感性的位點(diǎn)結(jié)合,通過變構(gòu)作用增強(qiáng)IATP,然而,鎘高于一定濃度時(shí),它們可能和非特異性或者不敏感性的位點(diǎn)結(jié)合,從而削弱低濃度鎘對(duì)P2X4受體的變構(gòu)作用,因此,IATP的幅度則從最大值開始逐漸降低。不過,這種推測(cè)還有待于在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步得到證實(shí),目前已有通過基因定向突變來(lái)確定調(diào)制物作用位點(diǎn)的相關(guān)報(bào)道[7]。下一步我們將通過對(duì)P2X4受體基因進(jìn)行定向突變,以確定抑制位點(diǎn)是否存在以及存在的位置。高濃度的重金屬中毒一般可以非特異性的改變細(xì)胞蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能,我們的初步研究顯示了重金屬鎘與P2X4受體結(jié)合位點(diǎn)具有一定的特異性,也可能通過非特異性的作用參與鎘中毒的機(jī)制。

另外,用鎘孵育細(xì)胞不同時(shí)間,發(fā)現(xiàn)鎘所誘導(dǎo)的IATP增強(qiáng)作用在120 s內(nèi)達(dá)到最大值(圖5),120 s之后,延長(zhǎng)鎘的作用時(shí)間對(duì)ATP-激活電流的影響并無(wú)顯著性差異。表明鎘對(duì)IATP的效應(yīng)有時(shí)間依賴性。

有研究表明,鎘能通過血-腦屏障,并能被神經(jīng)元攝取,在神經(jīng)末梢儲(chǔ)存并釋放,在鎘中毒的情況下,鎘在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以達(dá)到毫摩爾濃度的水平,通過影響P2X4受體的功能而影響突觸傳遞,進(jìn)而影響高級(jí)中樞(特別是大腦)興奮性[8],在這一點(diǎn)上,能幫助我們解釋鎘中毒時(shí)所表現(xiàn)的神經(jīng)癥狀。當(dāng)然,鎘還可以作用于其它受體或通道,如GABA、NMDA,和5-HT3離子型受體。

通過本實(shí)驗(yàn)研究,初步闡述了重金屬鎘對(duì)P2X4受體的作用及特征,并探討了作用機(jī)制。由于鎘對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的復(fù)雜性,還有很多方面需要進(jìn)一步研究,期待更加深入了解鎘中毒時(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)以及其它各器官系統(tǒng)的作用機(jī)理。

[1]Mendez-Armenta M,Rios C.Cadmium neurotoxicity[J].Environ Toxicol Pharmacol,2007,23(3):350-358.

[2]Monroe R K,Halvorsen S W.Cadmium blocks receptor mediated Jak/STAT signaling in neuronsby oxidative stress[J].Free Radic Biol Med,2006,41(3):493-502.

[3]North R A.Molecular physiology of P2X receptors[J].Physiol Re v,2002,82(4):1013-1067.

[4]朱 凡,張玉芹,程 華,等.表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞上的大鼠P2X4受體介導(dǎo)的ATP-激活電流特征[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2008,24(4):391-395.

[5]張玉芹,羅加烈,聶 輝,等.大鼠三叉神經(jīng)節(jié)不同直徑神經(jīng)元ATP-激活電流的特征[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2007,23(3):319-323.

[6]張玉芹,羅加烈,聶 輝,等.大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元ATP-激活電流的藥理學(xué)特性[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2007,23(1):64-68.

[7]Evans R J.Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors[J].EurBiophys J,2009,38(3):319-327.

[8]Minami A,Takeda A,Nishibaba D,et al.Cadmium toxicity in synaptic neurotransmission in the brain[J].Brain Res,2001,894(2):336-339.