張玉芹,田衛(wèi)華,彭 芳,徐 珍,聶永莉

(武漢科技大學醫(yī)學院生理學教研室,湖北 武漢 430065)

鎘是一種存在于自然界并在工、農業(yè)生產中廣泛應用的重金屬,主要來源于冶煉、電鍍、染料、蓄電池、采礦等行業(yè)中。鎘也是一種有毒的重金屬,它可污染環(huán)境和水體,是目前倍受關注的環(huán)境污染物。過量的鎘進入體內,會對許多組織器官產生毒性作用。動物實驗和人群流行病學資料表明,鎘具有神經(jīng)毒性,它能破壞血-腦屏障,進入中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起大腦的形態(tài)和功能改變[1]。鎘還對腎和生殖系統(tǒng)有很強的毒性。環(huán)境中的鎘對人體的潛在危害越來越引起人們的重視。然而,關于鎘的毒性作用機制雖然有很多學說,但迄今為止確切機制并不清楚。其中一種學說認為,鎘影響細胞膜的某些受體或通道,從而改變膜受體、通道的功能和信號傳遞而產生毒性作用[2]。嘌呤受體(purinoceptor,P)分為P1受體和P2受體,P1為腺苷受體,P2為ATP受體。ATP受體又分為離子通道型受體(P2X)和G蛋白偶聯(lián)受體(P2Y)兩種亞型。P2X4屬于離子通道型ATP受體超家族成員(P2X1～P2X7)之一,它廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)膠質細胞,還分布于胰腺、膽管、泌尿器官、生殖器官、消化管以及呼吸道等,是中樞及外周組織表達最為豐富的P2X受體之一[3]。細胞外的ATP與 P2X4受體(或通道)結合,發(fā)揮介導快速興奮傳遞的作用。然而,鎘中毒時是否有P2X4受體參與?目前還未見有關報道。鎘對P2X4受體功能有無影響?影響的特征和機制如何?本實驗用非洲爪蟾卵母細胞作為異體表達P2X4受體的載體,以P2X4受體介導的ATP-激活電流(IATP)為觀察指標,應用雙極電壓鉗技術,研究鎘對P2X4受體介導的ATP-激活電流的影響及其特征,以了解鎘的毒性作用是否與膜受體/通道有關,為鎘中毒的防治尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、重組質粒、藥品及試劑

成熟雌性非洲爪蟾(中國科學院生物遺傳與發(fā)育研究所提供)。大鼠頸上神經(jīng)節(jié)重組質粒pcDNA3-P2X4由Dr.G.Buell(Glaxo Insititute for Molecular Biology)構建。內切酶Xho I(Fermentas公司);體外轉錄試劑盒(Mmessage Mmachine T7 RNA Transcription Kit,Ambion公司);ATPNa2(Sigma公司);氯化鎘(Merk公司,德國);OR2溶液(mmol/L):NaCl 82.5,KCl 2.0,MgCl2·6H2O 1.0,HEPES 5.0,使用時 ,用1mol/L NaOH調節(jié)pH至7.4～7.6,過濾后使用;卵母細胞孵育液(mmol/L):NaCl 96.0、KCl 2.0、Mg Cl2·6H2O 1.0 、CaCl21.8、HEPES 5.0,調節(jié) pH 至7.4～7.6,使用前高壓滅菌,并加青霉素至100 U/L和丙酮酸鈉2 mmol/L。

1.2 主要實驗儀器設備

雙極電壓鉗放大器(OC-725C,美國Warner公司);微量注射儀(Micro4TM Nanoliter2000,美國WPI公司);微電極拉制儀(德國HEKA公司);8道灌流系統(tǒng)(ALA-VM8,Scientific Instruments,NY);微操縱器(美國WPI);Biophotometer核酸測定儀(Eppendorf公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(Gene公司)。

1.3 cRNA的體外轉錄及爪蟾卵母細胞顯微注射

CaCl2法制備感受態(tài)細菌,將P2X4受體的重組質粒轉化至大腸桿菌E.coliDH5α中擴增、質粒提取、純化、線性化,以線性化的DNA為模板,體外轉錄成cRNA。用無酶水將cRNA濃度調至1 ng/nl,放置-70℃冰箱備用。取成熟雌性爪蟾,冰浴麻醉,手術取卵,在無Ca2+的Ringers'液中加入1 g/L膠原酶進行消化,以去除卵母細胞的濾泡膜及血管膜。將卵母細胞置于孵育液中,在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7 h,將體cRNA注射到爪蟾卵母細胞的胞漿中,每個細胞注射40 nl～50 nl(濃度為1 ng/nl)。設空白對照組和注射等量三蒸水的對照組。在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,用于電生理研究。

1.4 電生理記錄

將注射P2X4受體cRNA的卵母細胞置于細胞池中,用Ringers'液以2 ml/min的速度灌流,電壓電極和電流電極分別充灌0.15 mol/L和3 mol/L的KCl溶液,按照我們研究室以前的方法[4]測出實驗細胞的靜息電位,膜電位鉗制為-60 mV。電流電極所記錄的信號經(jīng)過放大、轉換,輸入計算機采樣和存儲,并通過計算機實時監(jiān)測。用CytoBench軟件對數(shù)據(jù)進行采樣、存儲和分析。實驗所用的液體均在使用前臨時配制。ATP、CdCl2等均用標準細胞外液配制,并將pH調至7.4～7.6。ATP和鎘均通過8通道加藥系統(tǒng)給藥,給藥時間為20 s,加藥時間間隔為6 min。量-效關系曲線采用Hill方程進行擬合,I/Imax=1/(1+(EC50/C)n),I/Imax表示當前效應和最大效應百分比,EC50為半效能作用濃度,C為激活物濃度,n為Hill系數(shù)。實驗數(shù)據(jù)的處理及圖表的繪制采用Sigmaplot軟件。

2 結果

2.1 爪蟾卵母細胞表達的P2X4受體介導的ATP-激活電流

在-60mV的鉗制電位下,依次用含有1 μ mol/L、3 μ mol/L 、10 μ mol/L 、30 μ mol/L 、100 μ mol/L 、300 μ mol/L ATP的Ringers'液灌流卵母細胞,均可記錄到不同幅值的ATP-激活電流。隨著ATP濃度的增加,ATP-激活電流也隨之增大,呈濃度依賴性,300 μ mol/L ATP 誘導的 ATP-激活電流與高于 300 μ mol/L的ATP誘導的電流幅度并無顯著性差異(配對t檢驗,P＞0.25,n=5),飽和濃度為 300 μ mol/L(圖1)。在注射等量三蒸水和未注射cRNA的空白對照組的卵母細胞,應用同樣濃度的ATP,未誘導出電流。分別用含10 μ mol/L去甲腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺的Ringers'液灌流,也未記錄到任何電流,表明外加ATP所誘發(fā)的電流就是表達在爪蟾卵母細胞中P2X4受體激活所引起的。

2.2 鎘對爪蟾卵母細胞表達的P2X4受體介導的ATP-激活電流的影響

用含不同濃度的鎘和1 μ mATP的Ringers'液灌流細胞,發(fā)現(xiàn)鎘的濃度從0.1～ 30 μ mol/L,ATP-激活電流幅度可隨鎘濃度的增加而增大,當達到30 μ mol/L時,增強作用達最大,繼續(xù)增加鎘的濃度時,ATP-激活電流幅度不再增加反而減小(圖2)。單獨應用含不同濃度的鎘的Ringers'液灌流細胞不能誘發(fā)任何電流。

Fig.1 ATP-activated currents mediated by P2X4 receptor expressed in oocytes(Eh:-60mV)

Fig.2 Effect of cadmium of different concentrations on ATP-activated current mediated by P2X4 receptors expressed in xenopus oocytes

2.3 鎘對P2X4受體介導的ATP-激活電流量-效曲線的影響

以1 μ mol ATP誘發(fā)的ATP-激活電流為對照,觀察 10 μ mol/L鎘對ATP-激活電流的影響,結果表明,鎘可明顯增強P2X4受體介導的ATP-激活電流,這種增強作用是可逆的,在同一個細胞,用Ringers'液沖洗去除鎘的作用后,ATP-激活電流即可恢復到對照水平(圖3A)。細胞外應用不同濃度的ATP,記錄ATP-激活電流,繪出ATP濃度-反應曲線,然后將每一種濃度的ATP和10 μ mol/L的鎘共同灌流細胞,可使ATP的量-效曲線明顯左上移。圖3 B顯示的是有鎘和無鎘時ATP的濃度-反應曲線。在鎘的作用下,ATP-激活電流的 EC50從(17.1±1.5)μ mol/L降低到(9.8±1.8)μ mol/L(P＜0.01),Hill系數(shù)從1.14±0.13上升到1.57±0.36。但ATP-激活電流的最大值沒有因為鎘的作用而發(fā)生改變。

Fig.3 Effect of cadmium on magnifying ATP-activated currents mediated by P2X4 receptors

2.4 不同鉗制電位下鎘對P2X4受體介導的ATP-激活電流的影響

當ATP 濃度為 10 μ mol/L時 ,改變鉗制電位 ,觀察10 μ mol/L鎘對ATP-激活電流的影響。鉗制電位分別為-140 mV,-100 mV,-60 mV,-20 mV,20 mV,60mV時,鎘對ATP-激活電流的增強作用并無顯著性(ANOVA,P＞0.25,n=10,圖4),表明鎘對ATP-激活電流的增強作用并無電壓依賴性。

2.5 鎘孵育時間不同對P2X4受體介導的ATP-激活電流的影響

用10 μ mol/L的鎘分別孵育爪蟾卵母細胞20 s,60 s,120 s,180 s,300 s,再分別加入 1 μ mol/L ATP,觀察預加鎘孵育時間不同對ATP-激活電流的影響。實驗結果表明,預加鎘的作用時間在120 s左右,可使ATP-激活電流增強作用達到最大值(圖5),鎘的孵育時間為120 s,180 s和300 s時,鎘對ATP-激活電流增強作用在組間比較并無顯著性差異(n=5)。

Fig.4 Effects of cadmium on ATP-activated currents meditated by P2X4 receptors at different membrane potentials

Fig.5 Effects of cadmium on magnifying ATP-activated current with different pre-incubation times

3 討論

非洲爪蟾卵母細胞是一種應用最早、表達功能強大、適用范圍廣的基因表達體系之一。早期主要用它來表達珠蛋白、球蛋白、各種病毒蛋白等,后來,發(fā)現(xiàn)不同類型的離子通道和受體蛋白也可在爪蟾卵母細胞中表達。這種細胞不僅能有效和精確地翻譯外來的RNA,還能完成翻譯后的加工,如糖基化、磷酸化、蛋白裂解和向細胞膜轉運等步驟,最終使表達的蛋白質顯示一定的功能。爪蟾卵母細胞經(jīng)膠原酶消化后,去除濾泡膜和血管膜,用它表達P2X4受體,可避免內源性的嘌呤受體及其它受體的干擾,為專門研究所表達的受體(或通道)提供了良好的模型。P2X4受體廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中,參與興奮性突觸傳遞過程,同時還分布于多種組織器官,如消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等。P2X4受體是中樞及外周組織表達最為豐富的P2X受體之一。我們應用分子生物學技術,將體外轉錄獲得的P2X4受體的cRNA注射到非洲爪蟾卵母細胞中進行表達,我們實驗結果表明,P2X4受體能高效穩(wěn)定的表達于非洲爪蟾卵母細胞,注射后存活的細胞表達成功的機率達到70%以上,并可耐受電生理實驗中的多次加藥以及反復灌流。

對于注射P2X4受體cRNA的爪蟾卵母細胞,細胞外施加一定濃度的ATP,可誘發(fā)明顯的內向電流,(即ATP-激活電流IATP)并顯示濃度依賴性(圖1)。而在注射等量三蒸水和空白對照組的卵母細胞,用同樣濃度ATP的Ringers'液灌流時,未誘導出電流。目前尚無特異性的P2X4受體拮抗劑,為了解爪蟾卵母細胞是否還存在其它受體干擾IATP,分別用含10 μ mol/L 去甲腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺的Ringers'液灌流,也未誘發(fā)出電流。進一步證明實驗中所誘發(fā)的卵母細胞IATP是P2X4受體激活介導的。

細胞外的ATP是P2X4受體的內源性激活物。從圖1可以看出,ATP的濃度在一定范圍內,隨著ATP的濃度的增加,IATP的幅值也隨之增大。P2X4受體介導的IATP表現(xiàn)出較快的激活和緩慢失活的特性,兩者的時間常數(shù)均為秒級水平,遠遠慢于之前本研究室在大鼠三叉神經(jīng)節(jié)檢測到的IATP激活相和失活相時間常數(shù)的毫秒級水平[5,6]。當用含有1 μ mol/L的ATP和10 μ mol/L鎘的Ringers'液灌流同一細胞時,可使IATP明顯增強,這種增強作用表現(xiàn)為可逆性,因為在去除鎘的作用后,P2X4受體/通道能很快恢復至備用狀態(tài)。在未注射和已注射 P2X4受體cRNA的卵母細胞,單獨加入鎘未記錄到任何電流。表明鎘不能單獨誘發(fā)電流。我們推測,鎘對IATP的影響是通過作用于P2X4受體的胞外的結構域實現(xiàn)的。為了證明我們的推測,實驗中,預加不同濃度的鎘,再用含有ATP的Ringers'液灌流卵母細胞,結果發(fā)現(xiàn),隨著鎘的濃度增加,IATP的幅度也呈明顯增強效應,當鎘超過一定濃度(30 μ mol/L)時,IATP的幅度不再隨鎘的濃度增加而增加,鎘增強IATP的作用反而減弱(圖 2)。另外,我們還發(fā)現(xiàn),鎘對IATP的作用無電壓依賴性(圖4),在不同的鉗制電位下,鎘對IATP增強作用并無顯著性差異。由此可以認為,鎘的作用位點不是在P2X4通道內部,而是位通道外面,可能是與位于細胞外的位點相結合,通過對P2X4受體的變構作用實現(xiàn)的。為了證明這一假設,我們觀察了鎘對ATP-激活電流量-效曲線的影響,一定濃度的鎘,可使ATP-激活電流量-效曲線向左上移位(圖3B),EC50值接近減半。鎘對IATP的增強作用類似增加ATP的濃度,而不改變飽和濃度的IATP的最大幅值,表明鎘不是P2X通道的開放劑,而是通過對受體的變構,增加該受體與ATP的親和力而發(fā)揮作用。

已有研究表明,P2X4受體在胞外至少有2個以上相對獨立的金屬離子調制位點,已知Zn2+是內源性的調制物,作用于P2X4受體/通道兩個跨膜域(TM1和TM2)的胞外環(huán)的易化位點上,鎘對P2X4受體的作用和鋅的作用很相似,推測低濃度的鎘通過與P2X4受體胞外的易化通道的位點優(yōu)先結合,通過變構作用增強ATP與P2X4受體的親和力,從而增強IATP。為什么鎘的濃度超過30 μ mol/L(中毒濃度)對IATP產生抑制作用?在通道的胞外環(huán)是否存在抑制性位點?我們推測,鎘的濃度低于30 μ mol/L時,它們可能和P2X4受體的特異性或者敏感性的位點結合,通過變構作用增強IATP,然而,鎘高于一定濃度時,它們可能和非特異性或者不敏感性的位點結合,從而削弱低濃度鎘對P2X4受體的變構作用,因此,IATP的幅度則從最大值開始逐漸降低。不過,這種推測還有待于在后續(xù)實驗中進一步得到證實,目前已有通過基因定向突變來確定調制物作用位點的相關報道[7]。下一步我們將通過對P2X4受體基因進行定向突變,以確定抑制位點是否存在以及存在的位置。高濃度的重金屬中毒一般可以非特異性的改變細胞蛋白質的構象和功能,我們的初步研究顯示了重金屬鎘與P2X4受體結合位點具有一定的特異性,也可能通過非特異性的作用參與鎘中毒的機制。

另外,用鎘孵育細胞不同時間,發(fā)現(xiàn)鎘所誘導的IATP增強作用在120 s內達到最大值(圖5),120 s之后,延長鎘的作用時間對ATP-激活電流的影響并無顯著性差異。表明鎘對IATP的效應有時間依賴性。

有研究表明,鎘能通過血-腦屏障,并能被神經(jīng)元攝取,在神經(jīng)末梢儲存并釋放,在鎘中毒的情況下,鎘在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以達到毫摩爾濃度的水平,通過影響P2X4受體的功能而影響突觸傳遞,進而影響高級中樞(特別是大腦)興奮性[8],在這一點上,能幫助我們解釋鎘中毒時所表現(xiàn)的神經(jīng)癥狀。當然,鎘還可以作用于其它受體或通道,如GABA、NMDA,和5-HT3離子型受體。

通過本實驗研究,初步闡述了重金屬鎘對P2X4受體的作用及特征,并探討了作用機制。由于鎘對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的復雜性,還有很多方面需要進一步研究,期待更加深入了解鎘中毒時對神經(jīng)系統(tǒng)以及其它各器官系統(tǒng)的作用機理。

[1]Mendez-Armenta M,Rios C.Cadmium neurotoxicity[J].Environ Toxicol Pharmacol,2007,23(3):350-358.

[2]Monroe R K,Halvorsen S W.Cadmium blocks receptor mediated Jak/STAT signaling in neuronsby oxidative stress[J].Free Radic Biol Med,2006,41(3):493-502.

[3]North R A.Molecular physiology of P2X receptors[J].Physiol Re v,2002,82(4):1013-1067.

[4]朱 凡,張玉芹,程 華,等.表達在爪蟾卵母細胞上的大鼠P2X4受體介導的ATP-激活電流特征[J].神經(jīng)解剖學雜志,2008,24(4):391-395.

[5]張玉芹,羅加烈,聶 輝,等.大鼠三叉神經(jīng)節(jié)不同直徑神經(jīng)元ATP-激活電流的特征[J].中國應用生理學雜志,2007,23(3):319-323.

[6]張玉芹,羅加烈,聶 輝,等.大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元ATP-激活電流的藥理學特性[J].神經(jīng)解剖學雜志,2007,23(1):64-68.

[7]Evans R J.Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors[J].EurBiophys J,2009,38(3):319-327.

[8]Minami A,Takeda A,Nishibaba D,et al.Cadmium toxicity in synaptic neurotransmission in the brain[J].Brain Res,2001,894(2):336-339.