王文清，李偉，林蒙，張飛，侯小龍，萬進(jìn)，方建國

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢430030)

腎骨顆粒(批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z20080549)是一種以中藥牡蠣為主藥制成的中藥補(bǔ)鈣制劑，具有促進(jìn)骨質(zhì)吸收和形成，維持神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮、毛細(xì)血管正常滲透壓，保持血液酸堿平衡的作用?？捎糜趦和⒊扇嘶蚶夏耆巳扁}引起的骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)增生、骨痛、肌肉痙攣，小兒佝僂病等[1]。筆者對腎骨顆粒中多種成分的含量進(jìn)行了測定，以期為腎骨顆粒的質(zhì)量控制、質(zhì)量評價及其藥理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器AA6300型原子吸收分光光度計(jì)(日本島津公司)，UV2450型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，L8800型氨基酸自動分析儀(日本日立株式會社)。

1.2 試藥腎骨顆粒(湖北省益康制藥廠，批號:201000902，20101102，20101202，規(guī)格:每袋2 g)，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)準(zhǔn)品，購自Sigma公司，批號:AAS-18)，無水葡萄糖對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110833-201001)，鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所，批號:100806)，鈣單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液[國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，批號:GBW(E)080118]，水為去離子水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋酸鈣的測定采用化學(xué)滴定法測定腎骨顆粒中醋酸鈣的含量[2]。

2.1.1 樣品處理方法采用火焰原子吸收光譜法測定鈣元素的含量常先用濕法消化法對樣品進(jìn)行預(yù)處理[3-5]。濕法消化分為直接消化、回流消化和壓力密封消化。壓力密封消化是最先進(jìn)的消化方式，但使用壽命短、密閉要求高、價格昂貴，一時難以普及?；亓飨贿m用于成分簡單樣品的消化[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇直接消化法作為樣品處理方法。

2.1.2 供試品溶液的制備取腎骨顆粒2 g，精密稱定，置坩堝中，先于200～300℃下炭化至無煙，再高溫灼燒(550℃)3 h。用鹽酸1 mL潤洗殘?jiān)?，回收殘?jiān)缅F形瓶，加鹽酸10 mL、硝酸15 mL，在電爐上加熱至溶液變?yōu)闊o色，加水10 mL，冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 空白溶液的制備取鹽酸11 mL、硝酸15 mL，放在電爐上加熱至溶液變?yōu)闊o色，加水10 mL，冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 滴定精密量取供試品溶液10 mL，置錐形瓶中，加水20 mL，甲基紅試液1滴，滴加10%氫氧化鉀溶液至溶液顯黃色，繼續(xù)多加10 mL，再加鈣黃綠素指示劑少量，用0.05 mol·L－1乙二胺四乙酸滴定至溶液黃綠色熒光消失而顯橙色?？瞻兹芤和ú僮?。按每1 mL乙二胺四乙酸滴定液相當(dāng)于鈣2.002 mg計(jì)算。鈣含量(%)=(V－V空)×2.002×10－2/M，V:供試品消耗的乙二胺四乙酸的體積，V空:空白樣品消耗的乙二胺四乙酸的體積，M:腎骨顆粒的取樣量，結(jié)果見表1。

2.2 氨基酸的測定采用酸水解法測定腎骨顆粒中氨基酸的含量[6]。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)條件L-8800型氨基酸自動分析儀(日本日立株式會社);分析柱2.6 mm×150 mm不銹鋼柱(內(nèi)裝2619樹脂);柱溫:53℃;反應(yīng)溫度:98℃;標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度0.1 nmol·μL－1;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備取腎骨顆粒0.5 g，精密稱定，置水解管，加鹽酸10 mL、新蒸餾的苯酚3或4滴，將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空，然后充入高純氮?dú)?，再抽真空抽氮?dú)?，重?fù)3次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下將水解管封口，放入110℃恒溫干燥箱內(nèi)，水解22 h，取出冷卻。稀釋至50 mL，濾過。吸取1 mL移入5 mL量瓶中，置真空干燥系統(tǒng)抽干，用純化水洗滌數(shù)次，抽干取出，用pH=2.2的檸檬酸鈉緩沖液稀釋至刻度，即得。

2.2.3 測定結(jié)果將制備好的供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣，根據(jù)供試品峰面積和同時測定的標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸峰面積，計(jì)算含量[6]。結(jié)果見表2。

2.3 多糖本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法對腎骨顆粒中的多糖進(jìn)行含量測定[7]。結(jié)果3批腎骨顆粒(批號:201000902，20101102，20101202)中多糖的平均含量分別為2.12%，2.10%，2.20%，RSD分別為1.94%，1.56%，1.20%。

2.4 砷鹽、重金屬及其他元素

2.4.1 砷鹽含量按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄IXF砷鹽檢查法第一法古蔡法進(jìn)行[2]。結(jié)果腎骨顆粒中砷含量≤2.0×10－6。

表1 3批腎骨顆粒中醋酸鈣含量測定結(jié)果Tab.1Determination of the content of calcium acetate in 3 batch shengu granules

表2 3批腎骨顆粒中氨基酸含量測定結(jié)果Tab.2Determination of the content of amino acids in 3 batch shengu granules%

2.4.2 重金屬總量按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄IXE重金屬檢查法第一法進(jìn)行[2]。結(jié)果:腎骨顆粒中重金屬總量≤1.0×10－6。

2.4.3 磷含量按《中華人民共和國藥典》2010年版三部附錄VII A磷測定法進(jìn)行[8]。結(jié)果腎骨顆粒中磷含量為2.4×10－6。

2.4.4 鉛含量采用原子吸收分光光度法測定[9]。①儀器工作條件。燈電流:12 mA;狹縫寬:0.2 nm;測定方式:BGC-D2;檢測波長:217.0nm;乙炔流量:2.0 L·min－1;空氣流量:15 L·min－1。②標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。精密量取鉛標(biāo)準(zhǔn)液(500 μg·mL－1)0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置100 mL量瓶中，加去離子水至刻度，即得。③樣品溶液的制備。稱取腎骨顆粒10.0 g，放入坩堝內(nèi)，緩緩加熱使其炭化，冷卻后加入硝酸2 mL及硫酸5滴，加熱至白煙消失。再在550℃灼燒使之灰化，冷卻后加入鹽酸2 mL置水浴上蒸干，再加水2 mL，加熱2 min，加酚酞試液1滴，再滴入氨試液至上述溶液變微紅色。加入醋酸鹽緩沖液(pH=3.5)2 mL，渾濁，濾過，再用水洗滌沉淀，將溶液轉(zhuǎn)至10 mL量瓶，加水使成10 mL，即得[6]。④空白溶液的制備。將加入硝酸2 mL、硫酸5滴、鹽酸2 mL的另一坩堝置于水浴上使之蒸干，再加水2 mL，加熱2 min，加酚酞試液1滴，再滴入氨試液至上述溶液變微紅色。加入醋酸鹽緩沖液(pH=3.5)2 mL，將溶液轉(zhuǎn)至10 mL量瓶中，加水稀釋至10 mL，即得。⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將陰性樣品溶液和各標(biāo)準(zhǔn)溶液按儀器工作條件進(jìn)樣，測定吸光度。以溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:鉛元素陰性溶液的A為－0.000 7，與相同條件下去離子水的A相近，說明空白溶液無干擾。標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.015 502X－0.000 6，r=0.999 1。說明鉛元素濃度在0.5～5.0 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。⑥含量測定。取制備好的供試品溶液，按儀器測定條件測定A。將A代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鉛含量。結(jié)果批號為20100902，20101102，20101202的A分別為0.003 4，0.004 2，0.002 6，樣品溶液的A均＜0.5 μg·mL－1標(biāo)準(zhǔn)溶液的A。表明樣品溶液中的鉛均≤0.5 μg·mL－1，即鉛平均含量≤0.5×10－6。

3 討論

腎骨顆粒的藥效主要由其內(nèi)所含的醋酸鈣所產(chǎn)生，胡曉娟等[10]指出，鈣制品中鈣的含量是衡量鈣制品好壞的指標(biāo)。此外，《中華人民共和國藥典》2010年版一部首次在牡蠣中加入了含量測定項(xiàng)，并且規(guī)定以其中的鈣含量作為其含量測定的標(biāo)準(zhǔn)[2]。因此，鈣含量是評價腎骨顆粒的最重要指標(biāo)，測定腎骨顆粒中的鈣含量，對其質(zhì)量評價有著十分重要的意義。此外，多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌抗病毒、降血糖、治療肝腎疾病、消炎鎮(zhèn)痛等作用;氨基酸是人體不可缺少的營養(yǎng)成分之一;此外通過咨詢同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科專家，在腎內(nèi)科藥品中，對磷的含量有極為嚴(yán)格的要求。因此測定這些成分的含量，對于腎骨顆粒的質(zhì)量評價也有著重要意義。

由于中藥材受其生長環(huán)境的污染以及藥材種類自身特點(diǎn)[11]，有可能含有一定量的重金屬等有害元素，如汞、鉛、砷等，這些重金屬元素在進(jìn)入人體內(nèi)后很難排出，積累到一定程度會對人體造成很大的毒性，干擾人體正常生理功能，危害人體健康。因此測定腎骨顆粒中的重金屬，可為其質(zhì)量控制和臨床安全用藥提供科學(xué)依據(jù)?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版一部對顆粒劑中的重金屬限量沒有明確規(guī)定，參考2001年國家頒布的《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中對重金屬含量限度的規(guī)定:重金屬總量不得超過20 mg·kg－1(百萬分之二十)、鉛含量不得超過5 mg·kg－1(百萬分之五)、砷含量不得超過2 mg·kg－1(百萬分之二)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本品的重金屬含量極低，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

腎骨顆粒中醋酸鈣的含量為48.35%，多糖含量為2.14%。此外還含有17種氨基酸，其中人體必需氨基酸7種，總量為3.32%。磷含量2.4×10－6，砷鹽含量≤2×10－6，重金屬總量為≤1×10－6，鉛含量≤0.5×10－6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腎骨顆粒是一種營養(yǎng)成分含量高、有害成分含量低的補(bǔ)鈣中藥制劑。

(志謝:感謝湖北省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所對本實(shí)驗(yàn)中氨基酸測量提供的幫助!)

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