徐麗君，王開富，鄒欣，龔菂，黃光英

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢430030)

偏頭痛型血管性頭痛是青春期及中年女性的常見病、多發(fā)病，易反復(fù)發(fā)作，給患者帶來很大痛苦[1]。玄芷鎮(zhèn)痛片(原名頭痛靈片)在我院臨床使用多年，用于治療血管性頭痛，取得了良好療效。該制劑系由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科歷代名老中醫(yī)在長期臨床實踐的基礎(chǔ)上組方而成，雖使用多年，但從未進行實驗驗證。為確保玄芷鎮(zhèn)痛片口服用藥的安全性和有效性，筆者按照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布實施的《藥品注冊管理辦法》中有關(guān)中藥天然藥物注冊分類第6類的有關(guān)項目要求，進行該藥的鎮(zhèn)痛藥效學和急性毒理學研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥RB-200智能熱板儀(成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品)，AEL-200型電子分析天平(日本島津公司)，阿司匹林(佳木斯制藥廠提供，批號:091117)，冰醋酸(天津博地迪化工有限公司提供)，玄芷鎮(zhèn)痛片(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院藥學部提供，批號:20051210)。

1.2 動物昆明種小鼠，清潔級，雌雄按實驗要求而定，體質(zhì)量(20.0±2.0)g，動物合格證號:SCXK(鄂)2004-0007，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠扭體實驗取小鼠100只，雌雄各半，稱質(zhì)量標記后隨機分為5組，每組20只，玄芷鎮(zhèn)痛片低、中、高劑量組灌服藥粉混懸液(2.72，5.44，10.88 g·kg－1，以生藥量計)，陽性對照組灌服阿司匹林水溶液(0.40 g·kg－1)，陰性對照組灌服等量0.5%羧甲基纖維素鈉懸液。均每天1次，連續(xù)用藥7 d，末次給藥30 min后，各小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液(臨用前配制)，0.1 mL·(10 g)－1。5 min后觀察并記錄注射醋酸溶液后15 min內(nèi)出現(xiàn)的扭體反應(yīng)(腹部收縮內(nèi)凹，伸展后肢，臀部抬高，蠕行)的次數(shù)，并計算玄芷鎮(zhèn)痛片鎮(zhèn)痛率。鎮(zhèn)痛率(%)=每組鎮(zhèn)痛鼠數(shù)/每組總鼠數(shù)×100%[2-3]。

1.3.2 熱板實驗①動物篩選:將小鼠置55℃熱板儀上，用秒表記錄小鼠自投入熱板至出現(xiàn)添后足的時間(s)，作為該鼠的基礎(chǔ)痛閾。給藥前先測定每只小鼠的基礎(chǔ)痛閾，共測2次，剔除喜跳躍者，10 s＜基礎(chǔ)痛閾＜30 s為合格。②動物分組及處理:將篩選合格的小鼠(全部為雌性)，隨機分為5組，每組20只，玄芷鎮(zhèn)痛片低、中、高劑量灌服藥粉混懸液(分別為2.72，5.44，10.88 g·kg－1，以生藥量計)，陽性對照組灌服阿司匹林水溶液(0.4 g·kg－1)，正常組灌服等量0.5%羧甲基纖維素鈉懸液，均每天1次，連續(xù)7 d，于末次給藥后0.5，1，2，4 h按上述基礎(chǔ)痛閾測定法分別測定痛閾，如痛閾超過60 s，即停止測試而按60 s計，以免燙傷足部。實驗結(jié)果見表2。痛閾提高率(%)=(給藥后平均痛閾－給藥前平均痛閾)/給藥前平均痛閾×100%[3-4]。

1.3.3 玄芷鎮(zhèn)痛片最大耐受量實驗取昆明種小鼠40只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，隨機分成兩組，每組20只。實驗前禁食12 h，給藥組以玄芷鎮(zhèn)痛片清膏混懸液分兩次灌胃給予，給藥劑量為259.2 g·kg－1(按生藥量計)。取濃度為3.24 g·mL－1(按生藥量計)的玄芷鎮(zhèn)痛片藥液，按最大容積1.6 mL·(20 g)－1分兩次灌胃給藥;對照組同法給予對照溶液，1.6 mL·(20 g)－1，兩次用藥時間相隔8 h。

觀察動物體質(zhì)量變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物等，記錄所有動物死亡情況、中毒癥狀及中毒反應(yīng)起始時間、嚴重程度、持續(xù)時間等。對瀕死及死亡動物進行大體解剖，其他動物在觀察期結(jié)束后進行大體解剖。肉眼觀察主要臟器的體積、顏色、質(zhì)地等，若出現(xiàn)異常則對改變器官進行組織病理學檢查[5-6]。共觀察7 d，尤其是詳細觀察給藥后4 h內(nèi)動物的反應(yīng)情況，然后每天上下午各觀察1次。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS11.0進行數(shù)據(jù)分析，并采用χ2檢驗進行陽性率的比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠扭體實驗結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明，陽性對照組、玄芷鎮(zhèn)痛片各劑量組小鼠扭體次數(shù)顯著低于陰性對照組，其中陽性對照組和玄芷鎮(zhèn)痛片中、高劑量組扭體次數(shù)更少。玄芷鎮(zhèn)痛片高劑量組鎮(zhèn)痛率與陽性對照組相近，且扭體次數(shù)較接近陽性對照組，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義。提示各劑量玄芷鎮(zhèn)痛片對小鼠醋酸所致的疼痛有顯著鎮(zhèn)痛作用，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，且高劑量組鎮(zhèn)痛作用接近阿司匹林。

表1 5組小鼠扭體反應(yīng)測定結(jié)果Tab.1Effect of xuanzhi analgesic tablet on the writhing response induced by acetic acid in mice ±s

表1 5組小鼠扭體反應(yīng)測定結(jié)果Tab.1Effect of xuanzhi analgesic tablet on the writhing response induced by acetic acid in mice ±s

與陰性對照組比較，*1P＜0.05，*2P＜0.01Compared with negative control group，*1P＜0.05，*2P＜0.01

組別小鼠/只劑量/(g·kg－1)15 min扭體次數(shù)鎮(zhèn)痛率/%玄芷鎮(zhèn)痛片低劑量組202.7214.3±5.5*140中劑量組205.559.8±6.3*250高劑量組2010.887.2±6.5*260陽性對照組200.405.1±4.8*270陰性對照組2027.0±13.60

2.2 熱板實驗痛閾測定結(jié)果見表2與圖1。實驗結(jié)果顯示，玄芷鎮(zhèn)痛片各劑量組痛閾在用藥1，2，4 h均較正常組高，其中陽性對照組，玄芷鎮(zhèn)痛片中、高劑量組痛閾提高更明顯，玄芷鎮(zhèn)痛片中、高劑量組痛閾4 h較2 h明顯增高，而陽性對照組則增高不明顯;玄芷鎮(zhèn)痛片各劑量組痛閾提高率均大于或等于陽性對照組。提示玄芷鎮(zhèn)痛片能提高小鼠熱刺激所致疼痛痛閾，明顯提高痛閾率，并且作用持續(xù)時間較長。玄芷鎮(zhèn)痛片各劑量組與陽性對照組起效時間雖然相同，但作用持續(xù)時間長且效果優(yōu)于阿司匹林。

2.3 玄芷鎮(zhèn)痛片最大耐受量測定結(jié)果給藥組小鼠于給藥后4 h內(nèi)活動減少。兩組小鼠1周內(nèi)攝食、飲水、大便、黏膜、皮毛、呼吸等均未發(fā)生異常，且各組小鼠均無死亡。兩組小鼠體質(zhì)量及其體質(zhì)量增加率差異無統(tǒng)計學意義，見表3。7 d后，處死小鼠，作系統(tǒng)尸檢。結(jié)果各主要臟器均未發(fā)現(xiàn)異常變化。提示玄芷鎮(zhèn)痛片口服給藥的最大耐受量為259.2 g·kg－1(按生藥量計)，按體質(zhì)量計算相當于每日臨床劑量的476倍;按動物系數(shù)折算相當于每日臨床劑量的48倍;由于該藥使用后短期內(nèi)未見任何毒性反應(yīng)及死亡，提示其急性毒性較小，使用較安全。

表2 5組小鼠熱板實驗痛閾測定結(jié)果Tab.2Effect of XUANZHI Analgesic Tablet on the pain induced by hot plate in mices，±s

表2 5組小鼠熱板實驗痛閾測定結(jié)果Tab.2Effect of XUANZHI Analgesic Tablet on the pain induced by hot plate in mices，±s

與正常組比較，*1P＜0.05，*2P＜0.01Compared with normal group，*1P＜0.05，*2P＜0.01

組別小鼠數(shù)劑量/(g·kg－1)用藥前0.5 h1 h2 h4 h玄芷鎮(zhèn)痛片低劑量組202.7213.0±4.514.6±6.919.1±4.7*121.4±11.9*221.0±8.7*1中劑量組205.4415.9±5.514.9±4.723.6±8.1*224.0±7.1*233.4±18.4*2高劑量組2010.8814.1±4.814.3±6.722.8±5.3*225.9±14.6*232.4±16.4*2陽性對照組200.4015.6±5.411.6±3.525.3±5.3*223.3±7.8*224.2±13.9*1正常組20…16.7±7.012.5±4.713.7±8.115.8±6.718.9±7.3

表3 兩組小鼠最大耐受量實驗體質(zhì)量測定結(jié)果Tab 3Body weight of 2 groups of mice in MTD experiment ±s

表3 兩組小鼠最大耐受量實驗體質(zhì)量測定結(jié)果Tab 3Body weight of 2 groups of mice in MTD experiment ±s

組別小鼠/只體質(zhì)量/g/%給藥組死亡/只給藥前給藥后體質(zhì)量增加率20020.06±1.3224.24±1.8420.84對照組20020.31±1.2724.09±2.1018.61

3 討論

血管性頭痛是一種由于血管舒縮功能障礙引起的反復(fù)發(fā)作性頭痛，是臨床常見病、多發(fā)病。它包括西醫(yī)的偏頭痛、緊張性頭痛，以及與頭顱組織結(jié)構(gòu)無關(guān)的各種頭痛，屬中醫(yī)頭痛、頭風、偏頭痛等范疇[7]。1988年的全國流行病學調(diào)查顯示，血管性頭痛的患病率約為1%[1]。偏頭痛頻繁發(fā)作會嚴重影響患者的身心健康、日常生活以及工作與學習。玄芷鎮(zhèn)痛片由白芷、延胡索、川芎、丹參等中藥組成，具有活血鎮(zhèn)痛、平肝潛陽的功效。該藥臨床治療血管性偏頭痛療效確切。本實驗通過小鼠扭體實驗及熱板實驗，充分展示了該藥鎮(zhèn)痛作用，其作用強度與阿司匹林接近，且作用更持久。該結(jié)果充分印證了其組方的有效性及合理性。由于在多年臨床應(yīng)用中，未發(fā)現(xiàn)患者反饋有不良反應(yīng)，故認為該藥的毒性較低，實驗中由于無法測得半數(shù)致死量，故只能進行最大耐受量測定，實驗結(jié)果表明其最大耐受量達259.2 g·kg－1(按生藥量計)，已經(jīng)是能夠達到的最大口服給藥量，7 d后仍未見任何毒性反應(yīng)及死亡情況，說明該藥急性毒性較小，使用較安全。

文獻報道[7]小鼠熱板法在測定麻醉性鎮(zhèn)痛藥時較為適宜，舔足底動作不僅是脊髓反應(yīng)，而且可能與高級中樞有關(guān)。本實驗用熱板法觀察該藥的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果表明玄芷鎮(zhèn)痛片對熱刺激的疼痛止痛較為敏感，提示其鎮(zhèn)痛部位可能在中樞。采用扭體法觀察發(fā)現(xiàn)該藥能明顯減少小鼠因醋酸刺激所致扭體的次數(shù)，各劑量組對小鼠醋酸所致的疼痛有顯著緩解作用，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，高劑量組鎮(zhèn)痛效果接近阿司匹林組，提示該制劑對化學致痛也有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

[1]趙瑞成，周慎.偏頭痛辨治規(guī)律分析[J].湖南中醫(yī)雜志，2004，20(4):8－10.

[2]徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:228－229，886.

[3]陳冠林，周福生，王汝俊.康泰膠囊對內(nèi)臟高敏感性模型大鼠及小鼠的鎮(zhèn)痛作用研究[J].中藥材，2010，34(1):116－119.

[4]國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心.藥品技術(shù)審評論壇·藥物研究技術(shù)指導原則(征求意見稿)——中藥、天然藥物分冊[S].2003:23－25.

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局.中藥/新藥研究指南(藥學、藥理學、毒理學)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:203－204.

[6]偏頭痛診斷與防治專家共識組.偏頭痛診斷與防治共識[J].中華內(nèi)科雜志，2006，45(8):694－695.

[7]程體娟，楊軍英.嘛呢骨痹液的抗炎鎮(zhèn)痛作用實驗研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2004，15(1):34.