鄭中華 國 巍 于洪泉 郭 敏 丁麗娟 趙麗微 齊 玲

(吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是體內(nèi)天然的抗腫瘤藥物，可由人體的免疫系統(tǒng)正常表達(dá)，目前在美國TRAIL已進(jìn)入臨床Ⅱ期研究階段〔1〕。本課題組在以往研究中發(fā)現(xiàn)，TRAIL在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤誘導(dǎo)凋亡過程中，發(fā)生凋亡抵抗而不能引起腫瘤細(xì)胞凋亡〔2〕。因此，本文將研究TRAIL和化療藥物順鉑對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡的作用，為TRAIL作為新藥開發(fā)提供更進(jìn)一步的理論依據(jù)，此方面研究國內(nèi)還未見相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H596細(xì)胞株，37℃水浴后離心棄上清，將細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI 1640(美國Gibco公司)培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液，1∶3傳代。

1.2 TRAIL和順鉑作用細(xì)胞后細(xì)胞死亡率檢測〔3〕待細(xì)胞生長至90%時(shí)，用0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，以每孔8×103個(gè)細(xì)胞密度種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后單獨(dú)加入rhTRAIL(英國Peprotech公司，藥物終濃度分別為0、0.01、0.1、1、10和100 ng/ml)或與10μg/ml順鉑聯(lián)合作用，24 h后棄上清，0.01 mol/L PBS洗板，加入新鮮配制的酸性磷酸酶底物檢測溶液(上海生物工程技術(shù)公司)100μl，繼續(xù)培養(yǎng)90 min，每孔加入0.1 mol/L氫氧化鈉10μl室溫孵育5 min。酶標(biāo)儀405 nm處測定各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞死亡率 =(1－100 ×A405測定組/A405對照組)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以x±s表示，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

TRAIL(0.01、0.1、1、10、和 100 ng/ml)單獨(dú)或與10 μg/ml順鉑聯(lián)合作用細(xì)胞24 h，通過酸性磷酸酶法分析結(jié)果顯示:TRAIL單獨(dú)作用時(shí)，TRAIL濃度為1 ng/ml時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)死亡，死亡率為4.37%;隨著藥物濃度升高，細(xì)胞死亡率增加，10和100 ng/ml組細(xì)胞死亡率可達(dá)到13.15%和19.33%，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05);加入順鉑后可以明顯提高細(xì)胞的死亡率，0.1 ng/ml時(shí)細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)死亡，以后隨著TRAIL藥物濃度升高，死亡率仍增加明顯，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05或 P＜0.01)，見表1。

表1 TRAIL聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的作用(x±s)

3 討論

TRAIL是腫瘤壞死因子超家族中的成員之一，它能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對正常組織和細(xì)胞則無明顯毒性作用〔1〕。TRAIL選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而不損傷正常細(xì)胞的特點(diǎn)，使其成為一種近年來研究較多的潛在的抗腫瘤藥物〔4，5〕。TRAIL作用于細(xì)胞后，與細(xì)胞表面的死亡受體(DR)4或DR5結(jié)合后，結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)，再募集半胱氨酸蛋白酶8，使半胱氨酸蛋白酶8發(fā)生活化〔6，7〕，引起細(xì)胞死亡?；熕幬锟梢苑翘禺愋缘呐c腫瘤細(xì)胞結(jié)合，化療藥物在應(yīng)用治療量時(shí)，也會(huì)引起廣泛的化療副反應(yīng)。最近的研究顯示，非毒性劑量的化療藥物可以增加TRAIL對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用〔8〕。也有一些明顯的證據(jù)表明，TRAIL可以作為治療非小細(xì)胞肺癌的藥物，尤其是與化療藥物聯(lián)合作用時(shí)可以克服TRAIL抵抗作用〔9〕。

本實(shí)驗(yàn)采用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H596細(xì)胞株，應(yīng)用不同濃度TRAIL單獨(dú)作用24 h后發(fā)現(xiàn):從1 ng/ml TRAIL組開始，隨著藥物濃度升高，細(xì)胞死亡率開始增加，10和100 ng/ml組細(xì)胞凋亡水平增加較為明顯，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用不同濃度TRAIL聯(lián)合順鉑作用24 h后發(fā)現(xiàn):加入順鉑后可以明顯提高細(xì)胞的死亡率，0.1 ng/ml細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)死亡，隨著TRAIL藥物濃度升高，死亡率增加明顯(P＜0.05或P＜0.01)。說明順鉑可以增加TRAIL對非小細(xì)胞肺癌的誘導(dǎo)凋亡作用，但還需要進(jìn)一步深入研究兩者作用的機(jī)制。

1 Anita C，Ling Qi，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，(Online)，2009;(4):34-41.

2 Li YC，Tzeng CC，Song JH，et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(9):2716-29.

3 齊 玲，于洪泉，丁麗娟，等.Caspase-8在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抵抗TRAIL誘導(dǎo)凋亡中的作用〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011;37(4):612-6.

4 Walczak H，Miller RE，Ariail K，et al.Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo〔J〕.Nat Med，1999;5(2):157-63.

5 Ashkenazi A.Targeting death and decoy receptors of the tumour-necrosis factor superfamily〔J〕.Nat Rev Cancer，2002;2(6):420-30.

6 南栗巖，齊 玲，肖振晶，等.原代培養(yǎng)的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)死亡受體與TRAIL抵抗的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;9(31):3591-2.

7 Bellail AC，Tse MC，Song JH，et al.DR5-mediated DISC controls caspase-8 cleavage and initiation of apoptosis in human glioblastomas〔J〕.JCell Mol Med，2010;14(6A):1303-17.

8 Song JH，Tse MC，Bellail A，et al.Lipid rafts and nonrafts mediate tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand induced apoptotic and nonapoptotic signals in non small cell lung carcinoma cells〔J〕.Cancer Res，2007;67(14):6946.

9 Gajewski TF.On the TRAIL toward death receptor based cancer therapeutics〔J〕.J Clin Oncol， 2007;25:1305.