梅麗琴，曲云鵬，麻健豐，江明華

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 兒童口腔科，浙江 溫州 325027；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼陽(yáng)中心醫(yī)院 口腔科，遼寧 遼陽(yáng) 111000；3.溫州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 口腔修復(fù)科，浙江 溫州 325027；4.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325027）

霍亂毒素（cholera toxin，CT）是由霍亂弧菌分泌產(chǎn)生，引起霍亂腹瀉的主要作用物質(zhì)，由A、B兩個(gè)亞單位組成，A亞單位是整個(gè)毒素的活性中心；B亞單位（CTXB）沒(méi)有毒性，但它含有大部分毒素抗原的決定簇，有很強(qiáng)的抗原性和免疫原性，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，能與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂GMI結(jié)合，在霍亂的抗毒免疫中起重要作用[1-2]。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)CTXB是一種較為理想的免疫分子佐劑[3]?；蚍例x疫苗是近年的一個(gè)研究熱點(diǎn)，但現(xiàn)有的各種核酸防齲疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效能偏低，尚不能達(dá)到實(shí)用防齲的目的[4-5]。本實(shí)驗(yàn)將霍亂毒素B亞單位編碼基因（ctxB）克隆到真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB，并進(jìn)一步研究其在真核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況，為CTXB在防齲核酸疫苗中應(yīng)用前景做基礎(chǔ)性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及細(xì)胞株：大腸桿菌JM109購(gòu)自華美生物工程公司；CHO細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；重組質(zhì)粒p2355（含ctxB）及真核表達(dá)載體pVAX1獲贈(zèng)于遵義醫(yī)學(xué)院劉建國(guó)教授。

1.1.2 主要試劑和儀器：限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I、DNA分子量Marker和T4DNA連接酶均購(gòu)自大連寶生物公司；lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購(gòu)自AxyPrep公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；GoldViewTM核酸染料購(gòu)自賽百盛公司；Plasmid Mini Kit I購(gòu)自O(shè)mega公司；引物合成由上海生工生物技術(shù)公司完成。GM1為Sigma公司產(chǎn)品。羊抗CTBIgG抗體和CTB標(biāo)準(zhǔn)品為L(zhǎng)ist biological laboratories，Inc.產(chǎn)品。辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。BSA為北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀為上海三科儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒p2355中ctxB插入序列的測(cè)定：對(duì)含有ctxB的重組質(zhì)粒p2355進(jìn)行測(cè)序，按Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行。以重組質(zhì)粒p2355為DNA模板，分別以T7序列和載體近3’端序列：5’-atgatta aattaaaatttgg-3’為引物，通過(guò)一個(gè)測(cè)序反應(yīng)測(cè)通。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)合成：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的基因序列在National Bioscience Inc研制的分子生物學(xué)軟件oligo 6.0上設(shè)計(jì)合成并評(píng)價(jià)PCR引物。上游引物：5’-GCGGGTACCACCATGGATGACCGAAGCGACATCAAGC-3’；下游引物：5’-GGGAATTCTTAACTCTCAGCTGTCAAATAA TG-3’。在上游引物的5’端加入kozak啟動(dòng)序列和EcoR I酶切位點(diǎn)，在上游引物的5’端加入Not I酶切位點(diǎn)。

1.2.3 擴(kuò)增目的基因片段ctxB：以重組質(zhì)粒p2355為模板，按下列反應(yīng)體系依次加樣：ddH2O 36.9μL 10×Exbuffer 5μL，dNTP mixture（各2.5 mmol/L）4μL，上游引物（10 pmol/μL）1μL，下游引物（10 pmol/μL）1μL，LA Taq酶0.1μL，p2355 1μL，總體積50μL。采用的循環(huán)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 3 m 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃貯存。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣1%瓊脂糖凝膠，1×TAE，60 V×1 h檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，于-20 ℃保存。

1.2.4 重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB的構(gòu)建及酶切鑒定：PCR產(chǎn)物純化按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用EcoR I和Not I對(duì)純化的PCR產(chǎn)物及少量提取的載體質(zhì)粒pVAX1進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定后回收，按照目的基因ctxB與載體pVAX1 4:1的摩爾比在T4DNA連接酶的作用下16 ℃過(guò)夜連接。取上述連接產(chǎn)物1μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，轉(zhuǎn)化后的JM109涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB抗性篩選平板上。37 ℃培養(yǎng)16 h后，挑取單個(gè)菌落振蕩培養(yǎng)過(guò)夜并提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切進(jìn)行鑒定后，以可以切出目的基因條帶的為陽(yáng)性克隆，送至大連Takara生物技術(shù)公司測(cè)序，鑒定構(gòu)建重組質(zhì)粒序列。

1.2.5 脂質(zhì)體介導(dǎo)pVAX1-ctxB瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞：取1.0×105/mL的CHO細(xì)胞，接種至6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL。24 h后，細(xì)胞匯合度達(dá)50%～80%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染：①分別取96μL無(wú)血清培養(yǎng)基至4個(gè)1.5 mL Eppendorf管中；②取Lipofectamine 2000 4μL分別加至上面的96μL培養(yǎng)基中，勿碰管壁；③室溫放置5 min；④加上述溶液到3個(gè)含1～2μg重組質(zhì)粒及1個(gè)作為對(duì)照的含1～2μg空質(zhì)粒的1.5 mL管中；輕輕混合，室溫溫育15～30 min；⑤沿孔周圍將上述溶液加至6孔板中的4個(gè)孔中，其余2孔作為CHO空細(xì)胞對(duì)照；⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別于24、48、72 h吸去培養(yǎng)基，冷PBS洗細(xì)胞2次。

1.2.6 GM1-ELISA法檢測(cè)CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)物：①用10μg/mL的GM1包被96孔微孔板，每孔100 μg，4 ℃過(guò)夜。②BSA封閉移去包被液，用含5% BSA的PBS2Tween20溶液37 ℃封閉2 h。③加入CHO細(xì)胞上清液：移去封閉液，加入3種不同濃度細(xì)胞上清液稀釋液（1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 μg/mL），同時(shí)設(shè)對(duì)照孔。每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)平行孔，每孔100μL，37 ℃作用2 h。④洗滌：移去液體，用PBS2Tween20溶液洗滌3次，每次3 min。⑤加入一抗：每孔加入1:4000稀釋的羊抗CTB IgG抗體100μL，室溫作用45 min。⑥洗滌：操作同④。⑦加入酶標(biāo)二抗加入1:8000稀釋的辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG抗體，每孔100μL，室溫作用45 min。⑧洗滌：操作同④。⑨加入底物溶液：將底物OPD溶液加入96孔板，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔。每孔100 μL，室溫避光作用15 min。⑩加入終止劑測(cè)定OD值：每孔加入50μL的2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，立即測(cè)定492 nm的OD值。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增目的基因片段ctxB 以重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB為DNA模板，擴(kuò)增出約390 bp的目的基因片段；經(jīng)基因測(cè)序鑒定：該目的基因片段起始密碼ATG到最后1個(gè)密碼子，共有390 bp，與文獻(xiàn)中報(bào)道的ctxB基因?qū)?yīng)區(qū)域的DNA序列和氨基酸序列完全一致（見(jiàn)圖1）。

圖1 ctxB PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 GM1-ELISA法檢測(cè)CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)物 采用SPSS 13.0分析軟件對(duì)GM1-ELISA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，經(jīng)x2檢驗(yàn)，P<0.05，證實(shí)重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB蛋白表達(dá)產(chǎn)物可以與特異性抗體相結(jié)合，具有CTXB免疫源性。

3 討論

近年來(lái)CTXB作為佐劑已應(yīng)用于某些細(xì)菌、病毒與寄生蟲(chóng)等疫苗的研制中[6]。2000年何志勇等[7]將ctxB克隆到原核表達(dá)載體，并成功誘導(dǎo)重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)蛋白。選擇適宜的佐劑不僅能增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，更能作用于特定免疫細(xì)胞，從而選擇性地誘導(dǎo)形成針對(duì)特異性抗原的有效免疫應(yīng)答[8-9]。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CTXB具有促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的抗原遞呈作用，并通過(guò)B細(xì)胞LgA型的轉(zhuǎn)換使機(jī)體LgA增加，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子（IL-4、IL-5）等功能，并促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和分化，分泌Th2型細(xì)胞因子，有效地誘導(dǎo)局部黏膜免疫以及全身免疫，從而輔助目的基因片段增加免疫效果[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，將CTXB克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1中，通過(guò)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)?？梢栽谡婧思?xì)胞中高效表達(dá)具有CTXB蛋白，可以用來(lái)加強(qiáng)防齲基因疫苗的免疫效價(jià)，為下一步構(gòu)建多價(jià)防齲基因疫苗打下了基礎(chǔ)。

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[3] Liu C, Fan M , Bian Z, et al. Effects of targeted fusion anticaries DNA vaccine pGJA-P/VAX in rats with caries[J].Vaccine,2008,26(51):6685-6689.

[4] 孫梅芹,趙連三,王松,等.preS2S/adw真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其表達(dá)的初步研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2003,11(1):3-5.

[5] 曲云鵬,劉建國(guó),楊德琴.真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1的應(yīng)用[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,39(2):194-196.

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[7] 何志勇,李明峰,張惟杰,等. 霍亂毒素B亞單位基因(CtxB)的克隆及其表達(dá)[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào), 2000,32(2):149-152.

[8] Wang C,Luo J, Amer S, et al.Multivalent DNA vaccine induces protective immune responses and enhanced resistance against Cryptosporidium parvum infection[J].Vaccine, 2011,29(2):323-328.

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