回振龍，馬 蘭，李朝周

（1．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2．甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730070）

多花黑麥草（Lolium multiflorum）又名意大利黑麥草、一年生黑麥草，是具世界栽培意義的禾本科牧草，其具有生長速度快、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、適口性好和營養(yǎng)價(jià)值豐富等優(yōu)點(diǎn)［1－2］。而中國現(xiàn)正面臨著酸雨污染面積擴(kuò)大、酸雨酸度增大、頻次增多、污染嚴(yán)重的困擾，這對多花黑麥草的栽培及生長發(fā)育造成嚴(yán)重的影響［3－4］。鈷是許多植物和微生物必需的微量元素之一。植物一般含有0．05～0．50 mg·L－1的鈷，豆科植物含量較高，禾本科植物含量較低［5］。反芻動(dòng)物瘤胃微生物合成維生素B12也需要鈷的參與［6］，所以在畜牧業(yè)生產(chǎn)中要給畜禽補(bǔ)飼一定數(shù)量的鈷鹽，最好的方式是大面積草地小劑量噴灑［7］。而關(guān)于施鈷對酸脅迫下植物種子的萌發(fā)及幼苗生長狀況的影響還鮮見報(bào)道。本研究就CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草種子的萌發(fā)及幼苗生理特性的影響進(jìn)行探討，旨在進(jìn)一步認(rèn)識鈷在植物逆境生理生態(tài)中的作用，為中國酸雨多發(fā)區(qū)多花黑麥草的生產(chǎn)及畜牧業(yè)的發(fā)展提供理論支持。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用多花黑麥草種子由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所提供。

1．2 酸溶液的配制 本試驗(yàn)酸溶液由分析純濃硫酸（98%）和蒸餾水混合而成。將硫酸配制成pH值為1．0的母液，用上海雷磁儀器廠生產(chǎn)的pH－29A型數(shù)顯酸度計(jì)測定并配制出pH值分別為3．0、4．0、5．0和5．8（蒸餾水）的酸溶液。

1．3 測定指標(biāo)與方法

1．3．1 預(yù)處理 試驗(yàn)前將種子用1%的次氯酸鈉溶液浸種30min消毒，然后用清水反復(fù)沖洗后備用。

1．3．2 CoCl2溶液浸種對多花黑麥草種子萌發(fā)的影響 在50mL三角瓶中分別加入不同濃度（0、0．000 5、0．002、0．01、0．1、1．0和10mmol·L－1）的CoCl2溶液各25mL。按國家種子質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)［8］隨機(jī)抽取預(yù)處理多花黑麥草種子各300粒放入盛有不同濃度CoCl2溶液的三角瓶中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)暗中浸泡24h（20±2℃）。次日將盛有不同濃度CoCl2溶液浸種的多花黑麥草種子吸干表面水分后整齊擺放于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿中各放100粒（培養(yǎng)皿事先在120℃烘箱內(nèi)放置4h后冷卻至室溫），每個(gè)處理水平重復(fù)3次，放入培養(yǎng)箱中（20±2℃）進(jìn)行催芽。每天補(bǔ)充等體積蒸餾水以確保培養(yǎng)環(huán)境的濕潤。發(fā)芽以胚根長度達(dá)到種子自身長度為標(biāo)準(zhǔn)［9］，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù)。計(jì)算發(fā)芽率（8d，測試種子發(fā)芽數(shù)占測試種子總數(shù)的百分比）、發(fā)芽勢（4d，發(fā)芽過程中日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰時(shí)發(fā)芽的種子數(shù)占供測樣品種子數(shù)的百分率［10－11］）和根長抑制指數(shù)（正常情況下的根長減去經(jīng)處理后根長的差與正常根長的比值的百分?jǐn)?shù)［12］）。

1．3．3 CoCl2對酸溶液脅迫下多花黑麥草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響 根據(jù)CoCl2溶液浸種對多花黑麥草種子萌發(fā)試驗(yàn)的結(jié)果分別選取0．01和0．1 mmol·L－1的CoCl2溶液浸種24h后的多花黑麥草種子50粒，整齊擺放于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入pH 值為3．0、4．0、5．0、5．8的酸溶液5mL，每個(gè)處理水平重復(fù)3次。將放有種子并加入酸溶液或蒸餾水的培養(yǎng)皿放入光照培養(yǎng)箱中（20±2℃）進(jìn)行催芽。每天更換等體積相應(yīng)的酸溶液以確保酸溶液的pH值不變。計(jì)算發(fā)芽率（8d）、發(fā)芽勢（4d）［10－11］、根長抑制指數(shù)［12］。于第10天對幼苗進(jìn)行各項(xiàng)抗性生理指標(biāo)的測定。

1．3．4 抗性生理指標(biāo)的測定

葉綠素含量：采用丙酮顯色法［13］。用722N型分光光度計(jì)測定663、646和470nm波長下的光密度值。

丙二醛（MDA）含量：采用硫代巴比妥酸（TBA）法［13］。

超氧化物歧化酶（SOD）活性：采用分光光度法，以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光氧化還原一半的酶量定義為一個(gè)酶活力單位［14］。

過氧化物酶（POD）活性：采用愈創(chuàng)木酚比色法，以每分鐘光密度變化值表示酶活性的大?。?4］。

細(xì)胞膜穩(wěn)定指數(shù)（MSI）：參照Sairam 等［15］的方法。

O－2·的產(chǎn)生速率：參照王愛國和羅廣華［16］的方法，測定環(huán)境中的光照強(qiáng)度為120μmol·m－2·s－1。

H2O2含量：參照林植芳等［17］的方法。

1．4 數(shù)據(jù)處理 各項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3～5次，數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，取P＜0．05為顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2．1 CoCl2溶液浸種及酸脅迫對多花黑麥草種子萌發(fā)的影響 除10．0mmol·L－1CoCl2溶液浸種處理顯著抑制種子萌發(fā)外，其他濃度CoCl2溶液浸種均不同程度地促進(jìn)了多花黑麥草種子的萌發(fā)（表1）。當(dāng)CoCl2濃度為0．01mmol·L－1時(shí)，發(fā)芽率最高，比對照增加了11．09%。

CoCl2溶液對多花黑麥草根的抑制強(qiáng)度隨著濃度的增加而增強(qiáng)，10．0mmol·L－1處理根長抑制指數(shù)為44．13%（表1），且根尖發(fā)黑。

CoCl2對酸脅迫下多花黑麥草種子萌發(fā)的影響因CoCl2溶液濃度和酸溶液酸度而異（表2）。適宜濃度CoCl2處理對酸脅迫下多花黑麥草種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用，尤以0．1mmol·L－1CoCl2的促進(jìn)作用較明顯。

表1 CoCl2溶液浸種對多花黑麥草種子萌發(fā)的影響Table 1 Influences of CoCl2on germination of seeds of Lolium multiflorum

表2 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草種子萌發(fā)的影響Table 2 Influences of CoCl2on germination of seeds of Lolium multiflorumunder acid stress

從根長抑制指數(shù)的變化趨勢來看，酸溶液脅迫抑制多花黑麥草種子的生根，酸溶液酸度越大抑制作用越強(qiáng)（表2）。

2．2 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗生長發(fā)育的影響 酸脅迫時(shí)，0．01和0．1 mmol·L－1CoCl2對多花黑麥草芽長和地上部干質(zhì)量均有一定的促進(jìn)作用，且0．1mmol·L－1CoCl2的促進(jìn)作用較為顯著（圖1）。

2．3 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗抗性生理的影響

2．3．1 葉綠素含量、MDA含量和 MSI CoCl2溶液浸種處理在一定程度上提高了多花黑麥草幼苗的葉綠素含量。0．1mmol·L－1CoCl2溶液對酸脅迫下幼苗葉綠素的降解具有一定的保護(hù)作用（圖2）。

0．01和0．1mmol·L－1CoCl2可在一定程度上減少M(fèi)DA含量的增加，說明0．01和0．1mmol·L－1CoCl2可減少酸脅迫下幼苗脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的累積（圖2）。

多花黑麥草幼苗MSI隨著酸溶液強(qiáng)度的增加而下降。0．01和0．1mmol·L－1CoCl2溶液處理幼苗MSI均顯著高于相同酸度對照處理（圖2）。

2．3．2 超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性 酸脅迫下多花黑麥草幼苗SOD活性隨著酸溶液酸度的增加而降低。CoCl2濃度為0．1mmol·L－1時(shí)幼苗SOD活性升高最明顯（圖3）。

酸脅迫下多花黑麥草幼苗POD活性隨著酸溶液酸性增強(qiáng)先升高后降低。CoCl2濃度為0．1 mmol·L－1時(shí)對酸脅迫下多花黑麥草幼苗POD活性增強(qiáng)的抑制作用最顯著（圖3）。

2．3．3 O－2·產(chǎn)生速率和H2O2含量 多花黑麥草幼苗O－2·產(chǎn)生速率和H2O2含量隨著酸溶液酸性的增加逐漸增大（圖4）。0．01和0．1mmol·L－1CoCl2處理抑制了酸脅迫對幼苗脂質(zhì)過氧化的作用，且酸性越強(qiáng)其作用越明顯。

3 討論與結(jié)論

一般認(rèn)為鈷并非植物必需的微量元素，就鈷是否為所有高等植物所必需尚未形成定論，但它對一些植物有積極的作用已被確定［18－19］，具體表現(xiàn)在適宜濃度范圍的鈷對植物種子萌發(fā)、幼苗生長具有一定的促進(jìn)作用［20］；能顯著提高小麥（Triticum aestivum）籽粒和秸稈的產(chǎn)量［21］；刺激植物生長，穩(wěn)定葉綠體［22］；對氨基酸、輔酶、蛋白質(zhì)的代謝也有影響［23］。此外，鈷對植物逆境生理也表現(xiàn)出了一定的作用，如適量的鈷對干旱脅迫下大豆（Glycine max）幼苗葉片有一定的保護(hù)作用［24］，能夠提高干旱脅迫下紫花苜蓿（Medicago sativa）種子的萌發(fā)及幼苗的生長［25］。它也是參與和構(gòu)造維生素B12特定結(jié)構(gòu)的元素［26］，參與植物體呼吸作用和能量代謝，穩(wěn)定葉綠素結(jié)構(gòu)［27］，而且鈷表現(xiàn)有促進(jìn)生長素和細(xì)胞分裂素形成及抑制乙烯產(chǎn)生的作用［19］。上述研究說明，鈷在植物生長發(fā)育及抗逆生理等方面具有一定的作用，但有關(guān)鈷對農(nóng)作物或牧草品質(zhì)和產(chǎn)量的影響并未取得一致的結(jié)果，這可能與供試土壤、鈷的使用濃度和作物類型及環(huán)境條件有很大的關(guān)系［19］。

圖1 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草芽長、地上干質(zhì)量和地下干質(zhì)量的影響Fig．1 Influences of CoCl2on shoot length，shoot dry weight and root dry weight of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

酸脅迫下鈷對牧草生長發(fā)育及抗逆生理的影響尚缺乏研究報(bào)道。本研究結(jié)果表明，CoCl2溶液浸種對多花黑麥草芽長和地上部干質(zhì)量均有一定的促進(jìn)作用，提高了多花黑麥草幼苗的葉綠素含量和細(xì)胞膜穩(wěn)定指數(shù)，在一定程度上減少丙二醛含量的增加，增強(qiáng)了超氧化物歧化酶的活性，對過氧化物酶活性的增強(qiáng)有明顯的抑制作用，并減緩了酸脅迫對幼苗脂質(zhì)過氧化的傷害。0．01和0．1mmol·L－1CoCl2都能較為有效的保護(hù)幼苗，減輕酸脅迫的傷害，但這種保護(hù)機(jī)制同時(shí)受到酸液酸度的影響，0．1 mmol·L－1CoCl2對酸溶液脅迫下多花黑麥草種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的保護(hù)作用最明顯。施用CoCl2可增強(qiáng)多花黑麥草幼苗的抗酸能力，緩解酸脅迫造成的傷害，其原因可能與鈷的生理功能有關(guān)，即鈷是乙烯合成重要酶——1－氨基環(huán)丙烷－1－羧酸氧化酶的抑制劑，通過抑制該酶的活性，鈷元素可顯著抑制乙烯的產(chǎn)生［28］。而乙烯作為植物體內(nèi)具有多種生理功能的重要激素之一，在植物細(xì)胞遭受較為嚴(yán)重的傷害時(shí)，乙烯與活性氧可以相互促進(jìn)對方的合成［29］。由此，通過抑制乙烯產(chǎn)生，鈷元素可能對酸脅迫下細(xì)胞膜的傷害起到一定的減緩作用。

圖2 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗葉綠素含量、丙二醛含量和細(xì)胞膜穩(wěn)定指數(shù)的影響Fig．2 Influences of CoCl2on chlorophyll，malondialdehyde content and membrance stablility index（MSI）of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

圖3 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的影響Fig．3 Influences of CoCl2on activities of SOD and POD of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

圖4 CoCl2溶液浸種對酸脅迫下多花黑麥草幼苗超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫含量的影響Fig．4 Influences of CoCl2on production rate of O－2·and H2O2content of seedings of Lolium multiflorumunder acid stress

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