趙林，韓彪，劉健，馬敏杰，魏寧

VEGF和MMP-2在食管癌中的表達及其意義探討

趙林1，韓彪2，劉健2，馬敏杰2，魏寧2

（1.臨洮縣中醫(yī)院，甘肅臨洮730500；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅蘭州730000）

目的探討VEGF和MMP-2在食管癌中的表達及其臨床病理意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測58例食管癌患者手術(shù)切除標(biāo)本中VEGF和MMP-2的表達。結(jié)果食管癌組織中VEGF表達率分別為60.3%（35/58），MMP-2表達率為79.3%（46/58）。VEGF和MMP-2的表達分別與食管癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，而與組織類型和分化程度無關(guān)。結(jié)論VEGF和MMP-2的協(xié)同表達在食管癌浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用，可作為反映食管癌進展的生物學(xué)指標(biāo)。

食管腫瘤；血管內(nèi)皮生長因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-2

許多研究提示，腫瘤組織內(nèi)的血管生成與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文應(yīng)用免疫組化法檢測58例食管癌患者手術(shù)切除標(biāo)本中血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（Matrix Metalloproteinase-2，MMP-2）的表達變化，探討其在食管癌發(fā)展過程中的的作用以及與食管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

收集蘭州大學(xué)第一醫(yī)院胸外科2006年12月至2010年1月間臨床資料完整的手術(shù)切除食管癌標(biāo)本58例?；颊吣挲g36～ 70歲，平均年齡57.3歲，男性45例，女性13例。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或其他針對腫瘤的治療，均在全麻下行食管癌根治術(shù)，術(shù)后病理均為食管癌，其中鱗癌46例、腺癌12例；癌組織分級G113例，G225例，G320例；UICC臨床分期：Tis2例，T12例，T218例，T333例，T43例；NO26例，N132例；M057例，M11例。14例正常食管組織取自食管切除斷段，距瘤緣10 cm，均經(jīng)病理證實為正常組織。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，制備成4～6μm厚度的連續(xù)切片，備染HE、原位雜交和免疫組織化學(xué)。

1.2 主要試劑

鼠抗人VEGF單克隆抗體，鼠抗人MMP-2單克隆抗體，即用型免疫組化染色S-P試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.3 方法

免疫組織化學(xué)染色：采用常規(guī)S-P法，切片經(jīng)脫蠟和水化后，組織抗原微波修復(fù)，10%羊血清封閉，滴加一抗，4℃過夜后加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育10 min，滴加鏈親和素—過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，各步驟間以PBS沖洗，5 min連續(xù)3次。DAB顯色后脫水、透明、封片。用PBS代替一抗體為陰性對照，用邁新公司提供的胃癌、乳腺癌和食管癌陽性片作為VEGF、MMP-2陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷

1.4.1 VEGF結(jié)果判斷免疫組織化學(xué)染色按照Kitadai等[1]的評分標(biāo)準(zhǔn)，以胞漿或胞膜染成棕黃色為陽性細(xì)胞，選擇染色均勻的癌間質(zhì)區(qū)，在高倍視野下，以著色細(xì)胞數(shù)占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比劃為：未見陽性細(xì)胞為陰性，陽性細(xì)胞＜30%為弱陽性，陽性細(xì)胞≥30%為陽性。

1.4.2 MMP-2結(jié)果判斷按照封國生等[2]的評分標(biāo)準(zhǔn)，以胞漿或胞膜染成棕黃色為陽性細(xì)胞，每例取3個高倍視野，每個高倍視野計數(shù)100個細(xì)胞，未見到陽性細(xì)胞為陰性，陽性細(xì)胞＜30%為低表達，≥30%為高表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗和Spearman等級相關(guān)分析，計量資料采用t檢驗和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF表達與食管癌臨床病理因素之間的關(guān)系

VEGF蛋白陽性物質(zhì)主要存在于癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)和胞膜，其表達有明顯的異質(zhì)性，強陽性表達的癌細(xì)胞常位于浸潤前緣，也有少量成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞表達陽性，正常對照組無陽性表達。其中，VEGF在58例標(biāo)本的陽性表達率分別為60.3%，其陽性表達率均與食管癌組織類型和分化程度無關(guān)，而與食管癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均呈顯著性相關(guān)（分別為P<0.01；P<0.01、P<0.05及P<0.05）。

2.3 MMP-2表達與食管癌臨床病理因素之間的關(guān)系

MMP-2陽性物質(zhì)位于癌細(xì)胞的胞漿和大部分間質(zhì)內(nèi)，表達程度不一，正常對照組未見陽性表達。其中，MMP-2在58例標(biāo)本的陽性表達率79.3%，兩者陽性表達率均與食管癌組織類型和分化程度無關(guān)，而與食管癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均呈顯著性相關(guān)（分別為P<0.05、P<0.01；P<0.05及P<0.05、P<0.01）。

2.4 VEGF和MMP-2表達的關(guān)系

58例食管癌組織中，VEGF和MMP-2表達一致的符合率分別為74.1%（43/58）。分析發(fā)現(xiàn)，兩種表達結(jié)果之間分別呈顯著性相關(guān)（χ2=8.795，χ2=12.06，均P<0.01）。

2.5 VEGF與MMP-2的相關(guān)關(guān)系

經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，VEGF和MMP-2的表達呈顯著性相關(guān)（r=0.681，P<0.01；r=0.676，P<0.01）。

3 討論

侵潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，誘導(dǎo)血管生成是惡性腫瘤生長、侵潤和轉(zhuǎn)移的前提之一。作為調(diào)節(jié)血管生成最主要的生長因子——血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF），其高水平表達與食管癌的形成、生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。

VEGF可直接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，是高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，最直接參與腫瘤的血管生成，可以增加血管通透性，有利于血漿蛋白、纖維蛋白原外滲，促進血管生成和新基質(zhì)形成[4]。本研究中，我們觀察到VEGFmRNA和蛋白表達與食管癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，且兩者表達之間呈顯著性正相關(guān)（r=0.929，P<0.01），表明VEGF mRNA和蛋白水平是穩(wěn)定的。國外學(xué)者[1]研究發(fā)現(xiàn)食管組織中VEGF表達與腫瘤的侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。郭文忠等[5]研究也證實了上述觀點，并發(fā)現(xiàn)VEGF的表達與食管癌的組織類型和分化程度無關(guān)，這些結(jié)果說明VEGF表達與食管癌血管形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用。

MMP是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶?；|(zhì)金屬蛋白酶具有降解細(xì)胞外基質(zhì)（ExtracellularMatrix，ECM）的作用，也是促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成的重要因子之一。MMP-2屬于Ⅳ型膠原酶，降解底物著重是構(gòu)成所有基底膜的主要成分—Ⅳ型膠原，降解產(chǎn)物除了對癌細(xì)胞有化學(xué)趨向性處，還可促進血管形成和腫瘤生長[6]。Koyama等[7]用原位酶譜分析技術(shù)研究了30例食管癌組織，發(fā)現(xiàn)MMP-2在癌巢周邊的間質(zhì)細(xì)胞表達陽性者12例，在癌巢中表達陽性者13例，另外5例在兩者中均有表達，MMP-2的表達與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管和血管侵犯相關(guān)。王曉峰等[8]對80例食管鱗癌組織、40例正常鱗狀上皮進行VEGF、CD44v6、 MMP-2免疫組化染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者陽性表達率相比差異均有顯著性（P<0.05），其在食管癌中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果表明，食管癌組織中MMP-2mRNA和蛋白在腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞均有陽性表達，其陽性率分別為75.9%和79.3%，其表達與食管癌分化程度、組織類型和患者的年齡、性別無關(guān)，而與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。mRNA和蛋白表達呈顯著性相關(guān)（r=0.891，P<0.01），說明MMP-2的表達和食管癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

VEGF和MMP-2的協(xié)同作用，促進了新生血管形成和ECM的降解，從而進一步加速腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Kurizahi等[9]研究發(fā)現(xiàn)人乳腺癌中活化的MMP-2表達與VEGF有顯著的相關(guān)性，并認(rèn)為VEGF可上調(diào)MMP-2的表達，在血管生成兩者可協(xié)同作用。Lamoreaux等[10]用VEGF處理體外培養(yǎng)的人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)VEGF可明顯促進內(nèi)皮細(xì)胞增生，并使MMP-2表達明顯增加，而MMP-2抑制劑（TIMP-2）表達則明顯下降，研究認(rèn)為VEGF可通過增加MMP-2分泌和減少TIMP-2對MMP-2抑制作用來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞源性MMP-2的活性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在mRNA和蛋白水平上，VEGF、MMP-2兩者在食管癌中的表達存在著顯著的相關(guān)性（r=0.681，P<0.01；r=0.676，P<0.01），說明兩者的協(xié)同表達在食管癌的侵潤、轉(zhuǎn)移及血管生成中具有非常重要的意義。結(jié)合本研究，我們認(rèn)為在食管癌的浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切中，VEGF可上調(diào)MMP-2的表達，兩者可協(xié)同作用。但這種調(diào)節(jié)的確切分子生物學(xué)機制尚待進一步研究。

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