占今舜，宋虎威，陳宇光，李麗立，張 彬*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 動(dòng)物生態(tài)營(yíng)養(yǎng)與健康養(yǎng)殖聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410125）

隨著分子生物學(xué)及基因工程的發(fā)展，利用自身基因在外源細(xì)胞中的克隆與表達(dá)也受世人關(guān)注。生物表達(dá)系統(tǒng)的出現(xiàn)滿足了科學(xué)發(fā)展的要求，并漸漸成為處理工農(nóng)生產(chǎn)以及醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域問(wèn)題的重要手段之一[1]。近年來(lái)，蛋白表達(dá)系統(tǒng)已有原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。不同的表達(dá)系統(tǒng)，其有不同的特點(diǎn)。如原核表達(dá)系統(tǒng)主要是大腸桿菌，其表達(dá)體系相對(duì)簡(jiǎn)單，目的蛋白無(wú)法經(jīng)過(guò)修飾加工，對(duì)于有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白就不宜用此表達(dá)系統(tǒng)[2]；哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，技術(shù)研究不夠成熟，外源基因在動(dòng)物體內(nèi)容易受到排斥，導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定，表達(dá)代價(jià)相對(duì)其他表達(dá)系統(tǒng)高很多；昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，缺陷主要是表達(dá)量不足，而且容易產(chǎn)生錯(cuò)誤的糖基化修飾[3]；真核表達(dá)系統(tǒng)主要是酵母體系，其中對(duì)畢赤酵母（Pichia pastoris）的研究最為熱門，該體系既有糖基化程度不高，對(duì)目的蛋白污染小，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求不高，其培養(yǎng)基易配置，便于高密度發(fā)酵表達(dá)等特點(diǎn)，又具有強(qiáng)效的啟動(dòng)子，還可對(duì)復(fù)雜的外源蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行翻譯后加工折疊和修飾過(guò)程，比如糖基化、蛋白折疊及生成二硫鍵等，是一種優(yōu)秀的真核生物表達(dá)系統(tǒng)[4]。經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)展，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已成為一個(gè)相對(duì)成熟和理想的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于工農(nóng)生產(chǎn)以及醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域。目前，已有數(shù)百種外源蛋白在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá)。

1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

畢赤酵母是甲醇酵母下的一個(gè)屬，能在含有甲醇的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)。其本身的強(qiáng)效啟動(dòng)子——醇氧化酶基因（AOX）是其他酵母表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法比擬的[5]。醇氧化酶只能以甲醇作為誘導(dǎo)劑，葡萄糖和甘油只會(huì)阻礙AOX啟動(dòng)子的調(diào)控途徑，抑制外源基因的表達(dá)。因此，當(dāng)培養(yǎng)基中只有甲醇時(shí)，AOX啟動(dòng)子就能強(qiáng)效嚴(yán)格的調(diào)控外源基因的表達(dá)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母兼?zhèn)湓撕驼婧藘煞N表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。其優(yōu)點(diǎn)如下：

1）經(jīng)過(guò)對(duì)畢赤酵母的研究，其全基因組序列已經(jīng)完全被弄清楚，其基因表達(dá)機(jī)制及調(diào)控也被研究比較透徹，實(shí)際運(yùn)用操作簡(jiǎn)單可行；

2）畢赤酵母中含有醇氧化酶（AOX）強(qiáng)效啟動(dòng)子，在甲醇的作用下，能以接近于大腸桿菌的繁殖速度迅猛生長(zhǎng)，強(qiáng)效的調(diào)控外源基因表達(dá)；

3）畢赤酵母具有完整的線粒體，高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能使結(jié)構(gòu)復(fù)雜的外源蛋白在畢赤酵母體系中表達(dá)，并對(duì)復(fù)雜外源蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行翻譯、加工、折疊和修飾，使目的蛋白具有一定的生物活性；

4）畢赤酵母能與一些分泌型表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)體系，使外源基因轉(zhuǎn)化入酵母體系后，目的蛋白能分泌表達(dá)到培養(yǎng)液中，從而降低菌體胞內(nèi)蛋白水解酶對(duì)目的蛋白的威脅，也很大程度地方便了目的蛋白的分離純化工作；

5）畢赤酵母表達(dá)體系不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，也不會(huì)出現(xiàn)特異性病毒或支原體污染等問(wèn)題，它不會(huì)對(duì)人體及自然環(huán)境的安全造成危害。

1.1 畢赤酵母表達(dá)宿主菌

畢赤酵母作為一種甲醇利用型酵母菌，主要包括Candida 和Pichia 2個(gè)種屬。當(dāng)前，用于外源基因表達(dá)的畢赤酵母菌株一般由Invitrogen公司構(gòu)建，主要有 NRRL-Y11430，GS115，KM 71，MC100-3，SMD1163，SMD1165和SMD1168等。 其 中NRRL-Y11430為野生型，其具有多個(gè)醇氧化酶基因啟動(dòng)子，需要利用大量甲醇來(lái)繁殖，由于大量的甲醇儲(chǔ)存容易引發(fā)火災(zāi)，故在實(shí)際生產(chǎn)中不常用。而常用的則是通過(guò)對(duì)野生型表達(dá)菌株NRRL-Y11430的1種或多種醇氧化酶基因啟動(dòng)子進(jìn)行剔除或替換改造而 得 到 的 GS115，KM71，MC100-3，SMD1163，SMD1165和 SMD1168等。另外，研究表明，在一定程度上，經(jīng)過(guò)改造的菌株比野生型菌株更具有表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢(shì)。目前，應(yīng)用最廣泛的宿主菌為GS115，該菌既有AOX1，又具有AOX2，使其在含有甲醇的培養(yǎng)基上能夠迅速生長(zhǎng)，大量地表達(dá)外源基因，其表型為Mut+。 KM71菌中只具有AOX2，其 AOX1基因被替換，而AOX2基因?qū)状祭媚芰^弱，因此為甲醇利用緩慢型，其表型為Muts[7]。另外，它必須在含有精氨酸外源供給的培養(yǎng)環(huán)境生長(zhǎng)。MC100-3菌既不具有AOX1，也不具有AOX2，使其不利用甲醇，其表型為Mut－。SMD1165，SMD1165 和SMD1168均含有AOX1基因，能在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。但它們基因組中缺失編碼蛋白酶A（pep4）和（或）編碼蛋白酶B（prb1）的基因，大大降低或清除了蛋白酶A、蛋白酶B以及羧肽酶Y這3種酶的活性，故稱為蛋白酶缺陷型菌株。由于降低或清除了蛋白酶，減弱了蛋白酶對(duì)外源蛋白的降解作用。因此，適用于分泌型表達(dá)。但其也具有明顯的缺點(diǎn)，其生長(zhǎng)速度比較慢，外源蛋白的表達(dá)效率不高，不太適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

1.2 畢赤酵母表達(dá)載體

畢赤酵母的表達(dá)載體一般為既能在大腸桿菌中表達(dá)又能在酵母細(xì)胞中表達(dá)的穿梭型質(zhì)粒。畢赤酵母細(xì)胞中的自然質(zhì)粒穩(wěn)定性都不佳, 只有將外源基因整合到宿主細(xì)胞的染色體基因組DNA，才能順利實(shí)現(xiàn)外源表達(dá)。常用的整合位點(diǎn)處在酵母基因組中的AOX1或HIS4基因位置。目前，常用的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的基因序列包含有乙醇氧化酶基因5′AOX1啟動(dòng)子和3′AOX1終止子，多克隆位點(diǎn)（MCS），組氨酸脫氫酶基因（His4）營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)（ori）。另外，分泌型載體 如：pPICZα、pPIC9 和 pPIC9K，都含有能調(diào)控外源表達(dá)蛋白分泌到胞外的信號(hào)肽序列α-factor序列。

1.2.1 啟動(dòng)子

畢赤酵母表達(dá)最常用的啟動(dòng)子是醇氧化酶AOX1。當(dāng)有甲醇存在時(shí)，該啟動(dòng)子就會(huì)被誘導(dǎo)和調(diào)控，幫助外源基因高效表達(dá)。Yu[8]利用AOX1啟動(dòng)子表達(dá)了超氧化物歧化酶（SOD）；Ghaffar 等[9]將目的基因整合入畢赤酵母GS115 中，利用表達(dá)載體的AOX1高效表達(dá)了來(lái)自嗜熱毛殼菌的耐熱木聚糖酶。由于甲醇對(duì)人體有毒害作用以及大量使用，容易帶來(lái)火災(zāi)隱患，在實(shí)際生產(chǎn)生活中存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，使不用甲醇作為碳源誘導(dǎo)的啟動(dòng)子備受關(guān)注，如依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶啟動(dòng)子（FLD1）和三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子（GAP）。研究人員利用GAP啟動(dòng)子成功誘導(dǎo)表達(dá)乙肝表面抗原、人類巨噬細(xì)胞集落刺激因子（hGM-CSF）和α-淀粉酶。另外，構(gòu)建重組畢赤酵母時(shí)，根據(jù)所表達(dá)的外源蛋白的特性和需要，也可以同時(shí)利用AOX1和GAP兩個(gè)啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體和重組酵母。呂中原等[10]在利用重組畢赤酵母表達(dá)S-腺苷甲硫氨酸合成酶時(shí)，既采用了GAP啟動(dòng)子又采用了AOX啟動(dòng)子，這兩個(gè)啟動(dòng)子的同時(shí)存在能在一定程度上提高表達(dá)產(chǎn)量。

1.2.2 篩選標(biāo)記

酵母表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記不僅可以提高陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，還可以提高高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選效率。如果載體篩選標(biāo)記選擇恰當(dāng)，可以使操作簡(jiǎn)單易行。當(dāng)前，篩選標(biāo)記主要有兩大類，即營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因和抗性基因。營(yíng)養(yǎng)缺陷型是因某一個(gè)特定氨基酸基因的缺失而常被用作陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選標(biāo)記，其包括his4、suc2、arg4等類型。抗性基因是依據(jù)基因劑量效應(yīng)和按對(duì)抗生素的抗性水平來(lái)快速篩選出高拷貝轉(zhuǎn)化子，其有G418和Zeocin等類型。目前，通常是先利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因篩選出陽(yáng)性重組子，然后再利用重組子的抗性基因篩選高拷貝數(shù)重組子。然而，Lin-cereghino等[11]構(gòu)建了新的表達(dá)載體pKANB 和pKANαB，此類載體上含有修飾過(guò)的Tn903kan′基因，可通過(guò)對(duì)G418的抗性直接篩選出高拷貝的酵母重組子，而且新構(gòu)建的表達(dá)載體不大，實(shí)際操作更簡(jiǎn)單且易行。

1.2.3 信號(hào)肽

像pPICZα、pPIC9和pPIC9k分泌型表達(dá)載體通常有一段信號(hào)肽序列α-factor。對(duì)于酵母本身，其分泌的蛋白較少，如能實(shí)現(xiàn)外源蛋白的胞外分泌性表達(dá)，不僅減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，還減少宿主細(xì)胞蛋白水解酶對(duì)目的蛋白的降解，這為目的蛋白后期的純化具有重要的作用，所以選擇合適的信號(hào)肽是提高外源蛋白表達(dá)效率的關(guān)鍵。通?？晒┻x擇的信號(hào)肽分為兩類: 酵母表達(dá)載體自身的信號(hào)肽和基因本身的信號(hào)肽。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，菌體胞外分泌表達(dá)常用的且最為有效的信號(hào)肽是α因子前導(dǎo)肽序列（α-factor） ，它可以通過(guò)AOX1 啟動(dòng)子來(lái)起始轉(zhuǎn)錄，從而使目的蛋白合成與菌體胞外分泌。Dong 等[13]通過(guò)α-MF 信號(hào)肽的介導(dǎo)，將克隆到畢赤酵母載體中的犀牛乳鐵蛋白基因成功表達(dá)到菌體細(xì)胞外。另外，姚清俠等[14]研究發(fā)現(xiàn)，外源基因本身的信號(hào)肽也能引導(dǎo)外源蛋白的分泌表達(dá), 但酵母表達(dá)載體自身信號(hào)肽可能要優(yōu)于外源基因蛋白的信號(hào)肽，而且信號(hào)肽具有選擇性，這就意味著在外源蛋白分泌型表達(dá)的應(yīng)用中，可以考慮摘除外源基因的信號(hào)肽。

2 外源蛋白的高效表達(dá)

由于畢赤酵母自身分泌蛋白少，因此表達(dá)的目的外源蛋白在菌體外的培養(yǎng)環(huán)境中的純度較高。研究表明，巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白水平可達(dá)到g/L。Huang等將克隆到畢赤酵母中的截短1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶基因成功表達(dá)，其表達(dá)量高達(dá)3 g/L；Hao等通過(guò)巴斯德畢赤酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組人復(fù)合α-干擾素(cIFN) 也達(dá)到1.24 g/L的水平。另外，有研究報(bào)道說(shuō)明，并不是所有的外源蛋白都可以在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，仍然有很多外源蛋白的表達(dá)效果不理想。在同一表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)不同的外源蛋白，其表達(dá)量千差萬(wàn)別，這是因?yàn)橥庠椿蛟诋叧嘟湍副磉_(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)受多方面因素的綜合影響，如外源基因的自身性質(zhì)、酵母的培養(yǎng)環(huán)境、表達(dá)的外源蛋白的特性等。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)優(yōu)化外源基因的內(nèi)部密碼子結(jié)構(gòu)、完善培養(yǎng)環(huán)境、抑制蛋白酶的降解作用和優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)等方法來(lái)達(dá)到外源蛋白高效表達(dá)的效果。

外源基因的自身特性與表達(dá)該外源基因的畢赤酵母的特性是否相匹配，是影響外源蛋白表達(dá)與否或表達(dá)效率的重要因素之一。受影響的外源基因自身特性主要包括基因序列的UTR序列(mRNA 5′端非翻譯區(qū))、A+T含量比、基因拷貝數(shù)和偏愛(ài)密碼子的出現(xiàn)頻率4個(gè)方面。