李環(huán)，王懷剛，趙鑫，蘇云明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

肺癌是最常見的嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，肺癌可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［1］。目前肺癌的治療主要有手術(shù)、放療、化療等常規(guī)治療。而中藥及復(fù)方都有著極其重要的補充作用［2－3］。靈芪膠囊是一種純中藥復(fù)方制劑，據(jù)前期研究具有良好的抗腫瘤特性。

1 實驗條件

1.1 瘤株 人肺腺癌細胞系A(chǔ)549由黑龍江腫瘤研究所提供。

1.2 制備血清實驗動物 Wistar大鼠20只，雄性，體質(zhì)量(250±50)g，由黑龍江省藥物安全性評價中心提供。合格證號為:黑醫(yī)實驗動物單項準第61號。

1.3 實驗所需要的藥品 靈芪膠囊由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥理實驗室生產(chǎn)，實驗時將其臨時配制成藥物溶液，每粒含生藥量約為1.65g。復(fù)方環(huán)磷酰胺片(批號H12021006，天津金世制藥有限公司)。

1.4 試劑及試劑盒

RPMl1640;小牛血清;胰蛋白酶;二甲基亞砜(DMSO);碘化丙碇(propidium iodide);AMV一步法RT－PCR擴增試劑盒;DEPC;瓊脂糖;Marker。

1.5 儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱;超凈工作臺;數(shù)顯電熱恒溫干燥箱;倒置相差顯微鏡;高速臺式離心機;低速離心機;研究用顯微鏡;電子天平;恒溫水浴箱;核酸蛋白分析儀;擴增儀;電泳儀;水平電泳槽;凝膠成像分析系統(tǒng)。

2 實驗步驟

2.1 靈芪膠囊含藥血清制備

取雄性大鼠20只，體質(zhì)量(250±50)g，隨機分為5組，每組4只，分別為靈芪膠囊低、中、高劑量組。分別給予靈芪膠囊 8.92、17.72、35.67g/kg/d，對陰性照組給予相等體積的0.9%NaCl，陽性對照給予0.026g/kg/d復(fù)方環(huán)磷酰胺片，按照說明書計量換算，各組均實施灌胃給藥，連續(xù)給藥7天，于最后一次灌胃給藥2h后，于下腔靜脈取血，在無菌操作臺內(nèi)操作，離心分離血清備用，用0.22μm微孔濾器過濾除菌，置于－20℃保存。

2.2 細胞培養(yǎng)過程

將凍存的A549細胞凍存管取出，迅速融化，迅速置于37℃水浴箱，復(fù)蘇細胞。于超凈工作臺內(nèi)打開凍存管，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，離心5min，1 500r/min，將細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶置于 CO2培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞貼壁，待至細胞長成單層后即可傳代。

在無菌條件下進行細胞傳代工作，去除培養(yǎng)瓶中的剩余培養(yǎng)液，用高壓鍋的無菌PBS沖洗3次，無菌處理過的吸管吸取0.25%胰蛋白酶，7～8滴，37℃，消化，在倒置相差顯微鏡下觀察，此時可見細胞皺縮，間距增大，細胞形態(tài)變圓，并出現(xiàn)的脫落時滴加1640培養(yǎng)液終止消化。取無菌吸管吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)的液體，離心后收集細胞，將離心后的細胞加入完全培養(yǎng)液，吹打形成單細胞懸液，分裝培養(yǎng)。

2.3 細胞總RNA提取

消化收集培養(yǎng)的A549細胞，經(jīng)含藥血清和空白血清分組作用72h，然后提取細胞總RNA，采用Trizol法，具體操作過程按照說明書進行。

2.4 紫外分光光度法測定RNA濃度

取RNA樣品，體積為1μL，加入DEPC水稀釋，最終定容至50μL，震蕩混勻，然后加入紫外分光光度計的比色杯中。儀器設(shè)備調(diào)零。在260nm和280nm處分別3次讀取吸光度值，然后為了準確取平均值。計算RNA濃度。公式如下:

RNA濃度(μg/mL)=40 ×OD(260)×稀釋倍數(shù)/1 000

RNA純度按慣例以O(shè)D(260)/OD(280)的比值表示，定量并將RNA濃度調(diào)整至0.5μg/μL。

2.5 逆轉(zhuǎn)mRNA至cDNA

反應(yīng)體系為:

管1

管2

將管2加入 管1中(共40uL)將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 PCR

2.6.1 PCR擴增引物的設(shè)計 見表1。

表1 各基因擴增產(chǎn)物的引物序列

2.6.2 PCR 反應(yīng)體系

2.6.3 PCR反應(yīng)條件 見表2。

表2 各種產(chǎn)物PCR擴增循環(huán)條件

2.7 圖像分析結(jié)果

取提取的Bcl－2的PCR產(chǎn)物，體積為10μl，采用瓊酯糖凝膠電泳的方法，溴化乙錠進行顯色，電泳條件如下:緩沖液為1xTAE，在電壓為110V，35min，紫外燈下攝片。以圖像分析儀分析實驗數(shù)據(jù)，得到結(jié)果如下:獲得各電泳條帶的吸光度值，以β2－MG光度值作為參考定量標準，經(jīng)計算求得待測基因/β2－MG的比值，以該比值作為待測基因mRNA含量，并計算相對表達量。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗方法，采用SPSS14.0 Windows統(tǒng)計學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以(s)表示。

3 實驗結(jié)果分析

3.1 RNA濃度的測定結(jié)果

紫外分光光度計顯示各實驗組RNA濃度均在1088～1654μg/mL之間，OD(260)/OD(280)值均在1.76 ～1.97 之間。

3.2 Bcl－2 mRNA的相對表達量結(jié)果

表3 LQC含藥血清作對A549細胞Bcl－2 mRNA的表達影響(s)

表3 LQC含藥血清作對A549細胞Bcl－2 mRNA的表達影響(s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

相對灰度值空白對照組組別 n Bcl－2 mRNA 0.995 ±0.083 LQC 血清高劑量組 4 0.580±0.027＊＊LQC 血清中劑量組 4 0.608±0.035＊＊LQC 血清低劑量組 4 0.725±0.087*復(fù)方環(huán)磷酰胺血清組 4 0.510 ±0.051 4＊＊

從各實驗組A549細胞Bcl－2擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖顯示的結(jié)果可以看出，給藥72h后，靈芪膠囊含藥血清組和復(fù)方環(huán)磷酰胺組經(jīng)測試得出結(jié)論Bcl－2mRNA的表達均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。說明靈芪膠囊含藥血清通過下調(diào)Bcl－2基因表達發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的作用(見表3，圖1)。

圖1 LQC含藥血清作用72h各組A549細胞Bcl－2擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

4 討論

細胞凋亡是一種基因控制的細胞程序性“自殺”現(xiàn)象，許多基因均參與凋亡的調(diào)控，如p53，C－myc，Bcl－2，Bcl－XL，Bax等。Bcl－2(B －cell lymphoma/leukemia－2 gene)是近年較受關(guān)注的一個凋亡抑制基因之一，它能夠抑制細胞凋亡，可以保護腫瘤細胞免受凋亡的過程，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的全過程［4］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在凋亡的腫瘤細胞中，Bcl－2 mRNA表達水平明顯下降。這些發(fā)現(xiàn)為臨床分子藥物設(shè)計提供了廣闊的前景和理論基礎(chǔ)。

本實驗結(jié)果證實了Bcl－2基因過度表達參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展。而在受試藥物靈芪膠囊含藥血清作用72h后，各處理組的Bcl－2基因表達明顯減弱，且為隨著藥物濃度的增加，其表達量明顯減少。實驗結(jié)果說明，實驗受試藥品靈芪膠囊可降低Bcl－2基因表達，從而促進人源性肺癌A549細胞的凋亡，而且其表達強度與藥物的濃度呈現(xiàn)負相關(guān)現(xiàn)象。這為中醫(yī)藥治療腫瘤提供了理論基礎(chǔ)和發(fā)展前景。

［1］楊靜.淺談肺癌從脾胃論治［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(3):144－146.

［2］王重洋，關(guān)欣，宋武元.艾迪注射液聯(lián)合化療治療晚期非小細胞肺癌臨床觀察［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(2):43 －44.

［3］張自強，齊路霞，郝靜.復(fù)方肺積散對小鼠Lewis肺癌抑制作用及與化療藥聯(lián)合應(yīng)用的實驗研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2009，37(1):33－34.

［4］Kukhta VK，Marozkina NK，Sokolchik IG，et al.Molecular mechanisms of apoptosis［J］.Ukr Biokhim Zh，2003，75(6):5 －9.