菅輝玲， 程 江， 黃 瑾， 高 蕊，3

neuritin(Nrn1)基因是1996年Nedivi等通過大鼠光刺激誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，在視皮質(zhì)中首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的可塑性相關(guān)候選基因15(CPG15)。它是一種與神經(jīng)系統(tǒng)可塑性密切相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長與分支，在神經(jīng)系統(tǒng)受損后發(fā)揮重要的再生修復(fù)作用［1～3］。研究表明Nrn1蛋白能促進(jìn)大鼠急性脊髓損傷后傷區(qū)軸突再生，并能促進(jìn)大鼠后肢運(yùn)動功能的恢復(fù)，部分改善運(yùn)動神經(jīng)元軸突的缺失［4～6］。Nrn1基因 mRNA 的3’非編碼區(qū)(UTR)作為其mRNA的重要組成部分，可能與microRNA(miRNA)結(jié)合而被引導(dǎo)發(fā)生降解或翻譯受阻。miRNA是一類長度約18-25nt的內(nèi)源性的非編碼 RNA，研究表明它與神經(jīng)變性疾病相關(guān)［7，8］。

MiR-124能通過下調(diào)不利于神經(jīng)元發(fā)育的眾多基因，誘導(dǎo)神經(jīng)元的分化，調(diào)控軸突外生并促使其向正常功能發(fā)育［9～11］。Lee 等［12］在小鼠大腦中動脈短暫梗阻動物模型腦組織基因表達(dá)差異的篩查中發(fā)現(xiàn)部分miRNAs可能在神經(jīng)元的損傷后修復(fù)中發(fā)揮重要作用。但是目前在國內(nèi)外還尚未見到關(guān)于miRNA調(diào)控Nrn1基因的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期采用solexa深度測序技術(shù)對腦缺血再灌注后2w及假手術(shù)大鼠腦組織的miRNA進(jìn)行測序、比對和差異分析發(fā)現(xiàn)了部分差異表達(dá)的miRNAs，而且部分miRNAs與Nrn1蛋白表達(dá)呈此消彼長的現(xiàn)象［13，14］。

基于上述背景，為進(jìn)一步驗(yàn)證這些可能種子miRNA對Nrn1基因的調(diào)控作用，需對Nrn1 mRNA的3’UTR區(qū)進(jìn)行克隆，并對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。本研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)研究對象，采用PCR技術(shù)克隆大鼠3’UTR區(qū)，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析;同時利用miRada軟件對3’UTR區(qū)miRNA可能結(jié)合靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，期冀發(fā)現(xiàn)與 Nrn1密切相關(guān)的miRNA。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化(北京)有限公司;克隆載體EZ-TTM購自北京康潤誠業(yè)(北京)有限公司。Axyprep plasmid minipred Kit購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司;Wizard SV Gel and PCR Clean-up System購自Promega公司;Xho I和Not I限制性內(nèi)切酶購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司;100bp、200bp DNA marker均購自TaKaRa;Taq DNA聚合酶等購自天根生化(北京)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)GeneBank發(fā)表的大鼠Nrn1序列(GenBank登錄號:NM_053346)，采用oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物，并在上游引物5’端引入了Xho I酶切位點(diǎn)，下游引物5’端引入了Not I酶切位點(diǎn)，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物信息如下(下劃線處為酶切位點(diǎn)):上游引物 F:5’-CCGCTCGAGACCTTAAGTCCGTCTTCACAC-3’;下游引物 R:5’-ATTTGCGGCCGCTCAAGGCTCTTTTATGTC-3’。

1.3 大鼠基因組DNA的提取 采取大鼠尾組織，酚/氯仿/異戊醇法抽提基因組 DNA，ddH2O溶解后，-20℃保存。DNA純度檢測OD260/OD280在1.8 ～2.0 之間。

1.4 大鼠Nrn1基因3’UTR的擴(kuò)增 以大鼠基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Nrn1基因3’UTR，反應(yīng)總體系為 25μl，其中上、下游引物各 0.5μl，模板1μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 5min;94℃30s，55℃30s，72℃30s，共計(jì)35 個循環(huán);72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 大鼠Nrn1基因3’UTR的克隆、鑒定及分析 將PCR產(chǎn)物回收并純化后，克隆于EZ-TTM載體中構(gòu)建EZ-TTM/Nrn1 3’UTR重組載體。將EZTTM/N1轉(zhuǎn)化E.coli DH5α并挑菌，利用菌落PCR初步鑒定陽性克隆。將初步鑒定陽性的克隆在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用AXYGEN質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用XhoI、NotI進(jìn)行雙酶切鑒定。選取陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測定，并對測定結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠Nrn1基因3’UTR克隆及鑒定

2.1.1 大鼠Nrn1基因3’UTR克隆 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，可見單一條帶，無非特異性擴(kuò)增，片段大小均為649bp(見圖1)。

2.1.2 大鼠Nrn1基因3’UTR陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定 將回收并純化的Nrn1 3’UTR與EZTTM載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取9個單克隆菌落作為模板，進(jìn)行PCR鑒定，1.5%，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示1～9泳道均在約649bp處擴(kuò)增出特異性條帶，初步鑒定為陽性克隆(見圖2)。

2.1.3 EZ-TTM/Nrn1 3’UTR 的雙酶切鑒定將菌落PCR初步鑒定的陽性克隆搖菌并提取質(zhì)粒。抽提的重組質(zhì)粒經(jīng) Xho I、Not I酶切后，可見約649bp的目的片段，大小與理論計(jì)算值相符。結(jié)果表明:Nrn1 3’UTR已成功插入EZ-T載體中(見圖3)。

2.1.4 EZ-TTM/Nrn1 3’UTR 重組質(zhì)粒測序結(jié)果 將北京六合華大基因科技股份有限公司測序結(jié)果與GenBank中的大鼠Nrn1核苷酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示:重組質(zhì)粒所含的Nrn1基因3’UTR序列同源性100%。證明大鼠Nrn1基因3’UTR序列成功克隆。附:部分測序結(jié)果(見圖4)。

2.2 不同物種Nrn1基因同源性比較分析 分別對不同物種Nrn1基因的CDS區(qū)與3’UTR區(qū)進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示大鼠Nrn1基因的CDS區(qū)與小鼠、倉鼠、人、恒河猴、矮黑猩猩和豬之間同源性很高，均在97%以上;而不同物種3’UTR區(qū)呈現(xiàn)較大差異，大鼠、小鼠與倉鼠間同源性較高，均在84%以上，大鼠與人、恒河猴、矮黑猩猩、豬的同源性較低。通過繪制進(jìn)化樹進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示大鼠與小鼠的親緣關(guān)系較近，與人、恒河猴、矮黑猩猩較遠(yuǎn)(見圖5)。

2.3 靶位點(diǎn)預(yù)測及同源性分析

2.3.1 Nrn1基因3’UTR 區(qū)miRNAs預(yù)測 利用miRanda軟件預(yù)測大鼠Nrn1基因3’UTR區(qū)miRNA結(jié)合靶標(biāo)位點(diǎn)，結(jié)果表明有11個 miRNAs在Nrn1基因上有結(jié)合位點(diǎn)，其中miR-204有兩個靶點(diǎn)(miR-204Target I和miR-204Target II)預(yù)測的分值與能值均較高，miR-758的靶標(biāo)位點(diǎn)(miR-758 Target)分值雖最高但能值較低(見表1)。

2.3.2 不同物種間Nrn1基因miRNA預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)比較與分析 根據(jù)miRanda軟件篩選的miRNAs靶標(biāo)位點(diǎn)，利用DNAMAN軟件對不同物種的靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示 miR-204TargetI和 miR-204TargetII在各物種 Nrn1基因3’UTR端同源性很高，均在85%以上。其中miR-204TargetI在大鼠、倉鼠、人、恒河猴、矮黑猩猩和豬之間同源性為100%，miR-204的第二靶點(diǎn)miR-204 TargetII在以上物種的保守性要低于第一靶點(diǎn)，形成兩類聚簇，大鼠、小鼠和倉鼠的序列保守性較高，人和靈長類動物恒河猴、矮黑猩猩之間同源率高達(dá)100%;相比之下 miR-758 Target和 miR-874 Target結(jié)合位點(diǎn)在各物種間差異較大，保守性較差，同源性僅為15%和34%。

表1 miRanda軟件預(yù)測大鼠Nrn1基因3’UTR靶標(biāo)位點(diǎn)

圖1 Nrn1 3’UTR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定

圖2 Nrn1 3’UTR陽性克隆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定

圖3 Nrn1 3’UTR重組質(zhì)粒的雙酶切電泳鑒定

圖4 EZ-TTM/Nrn1 3’UTR部分測序結(jié)果

圖5 不同物種Nrn1 3’UTR核苷酸的進(jìn)化樹

3 討論

目前，神經(jīng)修復(fù)與再生是一亟待解決的世界難題，神經(jīng)營養(yǎng)因子Nrn1在此過程中發(fā)揮了重要作用。Rickhag等［15］研究發(fā)現(xiàn)腦損傷后Nrn1基因的表達(dá)上調(diào)，這與腦損傷后腦組織中某些特異表達(dá)的miRNAs發(fā)生變化形成了鮮明的相關(guān)性［16］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Nrn1蛋白在大鼠腦缺血再灌注模型后7d表達(dá)顯著上升，至14d達(dá)到最高值，21d后蛋白表達(dá)水平下降［14］;隨后miRNA高通量測序結(jié)果表明部分miRNAs的表達(dá)與Nrn1基因的表達(dá)變化趨勢相反，其中尤以 miR-204的表達(dá)最明顯［13］。提示Nrn1基因的表達(dá)可能受到miR-204調(diào)控。

不同物種基因3’UTR的序列存在較大差異，但是miRNA的結(jié)合位點(diǎn)在不同物種中保守性較強(qiáng)，這也是預(yù)測miRNA靶標(biāo)基因的置信條件之一［17，18］。目前，國內(nèi)外尚未見有關(guān)Nrn1基因的靶miRNAs的報(bào)道。本研究首次克隆大鼠Nrn1基因3’UTR核心序列并對其編碼區(qū)(CDS)和3’UTR序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果表明Nrn1基因CDS在哺乳動物與人中高度保守，說明該基因在哺乳動物和人中可能發(fā)揮重要的作用，歷經(jīng)長時間物種進(jìn)化而亙古不變。各物種Nrn1基因3’UTR區(qū)同源性雖在70%以上，但物種間差異較大，在進(jìn)化中經(jīng)歷了序列變化與選擇的過程，該段序列可用于物種進(jìn)化樹分析，精確地反映種屬親緣關(guān)系(見圖5)。研究同時發(fā)現(xiàn)3’UTR區(qū)有2個高度保守的區(qū)段，推測Nrn1基因3’UTR保守區(qū)段可能發(fā)揮著某種重要作用而得以進(jìn)化保留。利用miRanda軟件發(fā)現(xiàn)了11個miRNAs的靶標(biāo)位點(diǎn)，落在保守區(qū)且分值、能值比較高的miRNA只有miR-204，且miR-204兩個結(jié)合位點(diǎn)中miR-204 TargetI的分值、能值要較miR-204 TargetII高，提示miR-204 TargetI靶標(biāo)調(diào)控Nrn1的可能性更大。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供了miR-204與Nrn1基因3’UTR序列相結(jié)合的可能性，結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果即Nrn1與miR-204基因表達(dá)量呈“此消彼長”的負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說明miR-204具有靶標(biāo)Nrn1基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)支撐和互作的生理、生化環(huán)境，提示miR-204在Nrn1基因表達(dá)調(diào)控中扮演著重要角色。本研究的結(jié)果為后續(xù)靶標(biāo)關(guān)系的驗(yàn)證以及深入探討相關(guān)miRNAs在Nrn1基因表達(dá)調(diào)控中的作用積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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