席冬梅，曾 勇

（三峽大學(xué)仁和醫(yī)院骨科，湖北 宜昌443001）

骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，MSC）在特定的生理和病理情況下，能遷移到特定的組織器官參與組織的修復(fù)重建[1-2]，且其作為骨組織工程的種子細(xì)胞已得到廣泛應(yīng)用[3]。目前的研究多集中于后期處理對(duì)MSC功能及分化的影響，而前期對(duì)所取得骨髓標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理的研究比較少見(jiàn)。因此，本研究對(duì)比了骨折預(yù)處理對(duì)兔MSC的影響，旨在為其更好地應(yīng)用于骨組織工程及其功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司（型號(hào)：FACSCalibur）。

1.2 動(dòng)物分組及骨折模型制作

12 周齡兔 10 只，雌雄不限，體質(zhì)量（2 512±48）g，購(gòu)于三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。按隨機(jī)數(shù)字表法分為骨折預(yù)處理組和對(duì)照組，每組5只。將骨折預(yù)處理組兔麻醉后沿股外側(cè)肌間隙鈍性分離進(jìn)入到達(dá)股骨干，在脛骨干中1/3段用線鋸鋸斷成橫形骨折，以直徑3mm克氏針作逆行髓內(nèi)固定，骨折固定牢固后，用生理鹽水沖洗傷口，碘伏消毒，關(guān)閉傷口。對(duì)照組未進(jìn)行任何處理。

1.3 MSC的培養(yǎng)

骨折預(yù)處理組骨折模型制作好7 d后，從另一側(cè)股骨處無(wú)菌抽取骨髓1～2 mL，用 5 mL PBS混勻后，離心機(jī)（1 000 r·min-1）離心 10 min。 將沉淀的MSC細(xì)胞重懸于5 mL 10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液中，2×106個(gè)接種于塑料培養(yǎng)瓶中。對(duì)照組從股骨抽取骨髓培養(yǎng)，方法同骨折預(yù)處理組。

1.4 MSC的周期測(cè)定

待細(xì)胞已鋪瓶底＞80%后，采用酶消化法常規(guī)消化細(xì)胞，離心，棄上清，PBS沖洗2次，加入4℃預(yù)冷的70%乙醇3 mL固定過(guò)夜。DPBS（杜氏磷酸緩沖液）洗滌、離心2次后，棄上清。細(xì)胞重懸于50μg·mL-1的 PI染液（含 50 μg·mL-1的 RNase）中，37 ℃避光水浴30min。300目濾布過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。傳代（P2-4）細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT（噻唑蘭）比色實(shí)驗(yàn)

分別檢測(cè)骨折預(yù)處理組與對(duì)照組傳代細(xì)胞（分別用P2、P3、P4表示）的增殖能力。常規(guī)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于培養(yǎng)基96孔板中，培養(yǎng)24 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS沖洗。加無(wú)血清DMEM后繼續(xù)培養(yǎng)至所設(shè)定的時(shí)間，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入180μL無(wú)血清DMEM （達(dá)氏必須基本培養(yǎng)基）＋MTT溶液20μL 37℃孵育4 h，吸出培養(yǎng)液，加150μL DMSO（二甲基亞砜），然后將孔板放置于搖床震蕩10min。上酶標(biāo)儀，選擇490 nm波長(zhǎng)，測(cè)各孔吸光度值，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MSC的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2組接種24 h后首次換液，對(duì)照組僅出現(xiàn)少量細(xì)胞貼壁現(xiàn)象（封四圖1A）；骨折預(yù)處理組貼壁細(xì)胞較多，并出現(xiàn)細(xì)胞集落（封四圖1B）。之后2～3 d骨折預(yù)處理組貼壁細(xì)胞明顯增大并迅速開(kāi)始分裂增殖，細(xì)胞伸出突起，呈梭形、紡錘形和多角形，細(xì)胞集落迅速增多，互相融合，5 d可鋪滿瓶底至80%左右（封四圖1C），已可進(jìn)行傳代。而對(duì)照組此時(shí)僅鋪瓶底約40%左右（封四圖1D），在8～9 d后可進(jìn)行傳代。

2.2 骨折預(yù)處理對(duì)MSC增殖的影響

骨折預(yù)處理組MSC的增殖能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組，在 P2、P3 代時(shí) MSC 高于對(duì)照組（均P＜0.05）；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，P4代時(shí)2組MSC增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 2組P2、P3、P4代時(shí)MSC增殖能力的比較 ±s

表1 2組P2、P3、P4代時(shí)MSC增殖能力的比較 ±s

*P＜0.05與對(duì)照組比較。

組別 n P2 P3 P4對(duì)照組 5 0.936±0.054 0.833±0.040 0.879±0.063骨折預(yù)處理組 5 1.111±0.084* 1.097±0.096* 0.887±0.043

2.3 細(xì)胞周期的測(cè)定

P4代MSC采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：骨折預(yù)處理組MSC中G0/G1期細(xì)胞為70.65%，G2/M期細(xì)胞為10.40%，S期細(xì)胞為18.95%；對(duì)照組MSC中G0/G1期細(xì)胞為72.40%，G2/M期細(xì)胞為11.35%，S期細(xì)胞為16.25%。2組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05）。

3 討論

MSC具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱及骨髓間質(zhì)等多種間充質(zhì)組織分化的潛能，并且當(dāng)機(jī)體某個(gè)部位受到損傷或發(fā)生慢性炎癥時(shí)，具有多向分化潛能的MSC及其衍生因子會(huì)向受損部位募集，參與組織的重建[4]。 有研究[5-6]表明，骨折后機(jī)體在創(chuàng)傷及缺氧等刺激下也會(huì)產(chǎn)生一系列炎癥因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素、集落刺激因子、SDF-1等，通過(guò)因子和受體的結(jié)合產(chǎn)生一系列的作用從而構(gòu)成了骨折修復(fù)的復(fù)雜級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，包括MSC動(dòng)員、募集到骨折部位及其增殖和分化為骨組織。此級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)階段發(fā)生在創(chuàng)傷后 48～72 h[7]，在此期間抽取外周血培養(yǎng)出的 MSC形成的集落數(shù)比其他時(shí)間點(diǎn)多[8]。

因此，筆者推測(cè)在骨折修復(fù)過(guò)程中，因?yàn)檠装Y因子和趨化因子的作用，MSC會(huì)表現(xiàn)的更加活躍。本研究發(fā)現(xiàn)，骨折預(yù)處理組7 d后采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)的MSC更容易出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，且細(xì)胞集落出現(xiàn)較早，在24 h首次換液后即可出現(xiàn)；首次傳代時(shí)間也出現(xiàn)的較早，約5 d左右。而對(duì)照組則需8～9 d才可以鋪滿瓶底至80%左右，進(jìn)行傳代，初步證實(shí)了筆者的推測(cè)。

通過(guò)進(jìn)一步的研究，筆者發(fā)現(xiàn)，骨折預(yù)處理組P2-3代的MSC具有比對(duì)照組更強(qiáng)的增殖能力，但該增殖能力經(jīng)過(guò)多次傳代后，至P4代時(shí)消失。推測(cè)隨著傳代的增加及時(shí)間的推移，機(jī)體內(nèi)環(huán)境對(duì)其的影響逐漸去除，至P4代時(shí)MSC已完全恢復(fù)正常。有研究表明：腦外傷患者血清表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)成MSC 增殖的作用[9]。還有研究[10]表明：雖然白血病細(xì)胞對(duì)MSC的增殖有明顯的抑制作用，但經(jīng)過(guò)多次傳代后去除了白血病細(xì)胞的影響，即可恢復(fù)MSC的正常增殖特性。因此表明白血病骨髓 CFU-F數(shù)目減少，但其MSC的功能是正常的。這些均與本研究的結(jié)果較為一致。

因此，筆者認(rèn)為，骨折預(yù)處理全骨髓貼壁法可在更短的時(shí)間內(nèi)成功的培養(yǎng)出穩(wěn)定的MSC，并且該細(xì)胞在P2-3代具有更強(qiáng)的增殖能力，直至P4代恢復(fù)常態(tài)，但導(dǎo)致其增殖能力提高與恢復(fù)的具體機(jī)制還需要研究者進(jìn)一步的研究。

[1]Ramirez M,Lucia A,Gomez Gallego F,et al.Mobilisation of mesenchymal cells into blood in response to skeletalmuscle injury[J].Br JSports Med,2006,40（8）:719-722.

[2]Bian Z Y,Li G,Gan Y K,et al.Increased number ofmesenchymal stem cell-like cells in peripheral blood of patientswith bone sarcomas[J].Arch Med Res,2009,40（3）:163-168.

[3]Giannoudis P V，Einhorn T A，Schmidmaier G，et al.The diamond concept-open questions[J].Injury，2008，39（S2）:S5-S8.

[4]Pittenger M F,Mackay A M,Beck S C,et al.Multilineage potential of adulthumanmesenchymal stem cells[J].Science,1999,284（5411）:143-147.

[5]Kitaori T,Ito H,Schwarz E M,et al.Stromal cell-derived factor 1/CXCR4 signaling is critical for the recruitmentof mesenchymal stem cells to the fracture site during skeletal repair in amousemodel[J].Arthritis Rheum，2009，60（3）:813－823.

[6]Forte G,Minieri M,Cossa P，et al.Hepatocyte growth factor effects on mesenchymal stem cells：proliferation，migration，and differentiation [J].Stem Cells，2006，24 （1）:23-33.

[7]Einhorn T A.The science of fracture healing[J].JOrthop Trauma，2005，19（10）：S4-S6.

[8]侯長(zhǎng)舉，朱振安，趙鑫，等.骨折后外周血間充質(zhì)干細(xì)胞濃度變化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)矯形外科雜志，2012，20（2）:160-164.

[9]Garland D E.Evidence for a humoralmechanism for enhanced osteogenesisafterhead injury[J].JBone JointSurg Am，1992，74（1）:152-153.

[10]Nagao T,Yamauchi K,Komatsuda M.Inhibition of human bone marrow fibroblast colony formation by leukemic cells[J].Blood，1983，62（6）:1261-1265.