曹 劍，王怡寧，石新琳，馬國濤，孔令燕，薛華丹，雷 晶，何泳藍，金征宇

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 1放射科 2心外科，北京 100730

近年來，通過干細胞移植治療急性心肌梗死的研究已經(jīng)取得了較大進展，文獻報道在宏觀上能夠觀察到干細胞治療后心室功能的恢復，但對于移植干細胞的分布分化等生物學過程尚缺乏深入了解［1-3］。分子影像學技術(shù)可以實現(xiàn)對移植細胞的動態(tài)、無創(chuàng)、高效和長期示蹤，特別是多模態(tài)成像的方法，將不同的技術(shù)有機結(jié)合起來以取長補短，是研究移植干細胞生物學過程的關(guān)鍵［4］。本研究以超小超順磁性納米氧化鐵顆粒 (ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)標記表達紅色熒光蛋白的F344大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，選擇磁共振和光學兩種成像模式，以期發(fā)揮磁共振成像組織分辨率高及光學成像敏感性和信噪比高的優(yōu)勢，對在體雙模成像的可行性進行初步探索。

材料和方法

實驗動物 健康F344大鼠10只，購自北京維通利華動物技術(shù)有限公司，體重250～300 g，性別不限，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所普通級動物房，所有動物實驗均按照中國醫(yī)學科學院動物管理條例執(zhí)行。本研究獲得北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物倫理委員會同意。

材料 表達紅色熒光蛋白 (red fluorescence protein，RFP)的F344大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞 (bone mesenchymal stem cells，BMSCs)及完全培養(yǎng)基 ［賽業(yè) (廣州)生物科技有限公司］，USPIO(Bayer Schering Pharma AG公司惠贈，德國)，0.01%多聚賴氨酸 (Sigma，美國)，MTS(Promega，美國)。1.5 T超導型磁共振掃描儀 (Signal Excite HD，GE，美國)，ALC-V8D小動物呼吸機 (北京吉安得爾科技有限公司)，PIXIS 1024BR CCD光學成像系統(tǒng)(中國科學院自動化研究所)。

USPIO標記F344大鼠BMSCs 配制濃度為USPIO 40μg Fe/ml、多聚賴氨酸 1.5μg/ml的含鐵培養(yǎng)基，其中多聚賴氨酸作為轉(zhuǎn)染劑，將狀態(tài)良好的BMSCs在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)孵育過夜(24h)，構(gòu)建USPIO-RFP雙標BMSCs。

USPIO標記的有效性及安全性檢測

普魯士藍染色:4%多聚甲醛固定雙標干細胞，加入等體積混合的2%亞鐵氰化鉀溶液和2%鹽酸溶液，顯微鏡下觀察，計算標記陽性率;計數(shù)3次取平均值。

電鏡檢查:(1)USPIO標記干細胞;(2)細胞固定 (戊二醛、四氧化鋨);(3)丙酮梯度脫水;(4)浸透;(5)包埋;(6)修塊;(7)制備50～60 nm超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，水洗晾干備用;(8)透射電鏡觀察并照相。

臺盼藍拒染實驗:0.05%胰酶消化細胞成單細胞懸液;取20 μl懸液滴入細胞計數(shù)板，隨后加入2滴2%臺盼藍溶液，顯微鏡隨機視野下計數(shù)100個總細胞，計數(shù)活細胞數(shù) (正?；罴毎槐蝗旧?，而死細胞被染成藍色);計數(shù)3次取平均值，并比較標記組細胞和陰性對照組活力。

建立F344大鼠心肌梗死模型及心肌注射雙標BMSCs 實驗組 (n=8)于腹腔麻醉成功后行氣管穿刺插管，小動物呼吸機輔助通氣條件下，開胸以6-0聚丙烯縫線結(jié)扎冠脈左前降支，術(shù)中監(jiān)測心電圖，以出現(xiàn)ST段抬高作為心肌梗死成功標志。建模成功后約10 min，直視下使用微量注射器于梗死心肌周邊注射雙標BMSCs(數(shù)量2.0×106，體積150 μl)，逐層縫合關(guān)胸，觀察15 min后拔管脫機。對照組(n=2)不做任何處理。

心臟磁共振成像示蹤標記BMSCs 實驗組及對照組均行心臟磁共振成像，實驗組分別于雙標干細胞移植后1 d、1周、2周及4周時進行磁共振掃描;對照組掃描1次即可。大鼠于磁共振檢查前行腹腔麻醉，胸部備皮，粘貼磁共振兼容電極片以實現(xiàn)心電門控。掃描采用3英寸線圈，選擇快速擾相位梯度回波序列進行短軸二腔心平面掃描，具體參數(shù):重復時間7.6 ms，回波時間3.5 ms，視野大小13 mm×13 mm，層厚/層間距2.0/0 mm，矩陣160×160，激勵次數(shù)4。選取實驗組磁共振圖像信號減低最明顯的層面，于工作站測量并比較注射細胞區(qū)域信號強度 (signal intensity，SI)變化率:ΔSI=|SIL-SIM|/SIM×100%，其中SIL及SIM分別為信號減低區(qū)域和正常心肌的信號強度，各部位所選感興趣區(qū)大小盡量保持一致(1～2 mm2)。

在體光學成像 磁共振成像結(jié)束后24 h內(nèi)，將F344大鼠經(jīng)腹腔麻醉，仰臥位充分暴露心臟區(qū)域，置于PIXIS 1024BR CCD光學成像系統(tǒng)中進行成像(綠色熒光激發(fā))。

離體光學成像 術(shù)后第4周在體光學成像結(jié)束后將F344大鼠麻醉處死，仰臥固定于操作臺分離取出心臟，生理鹽水沖洗后將心臟置于光學成像設(shè)備中，暗室條件下激發(fā)光成像，成像完成后將心臟浸泡在福爾馬林溶液中固定。

病理組織學檢查 心臟經(jīng)福爾馬林溶液浸泡固定，根據(jù)術(shù)中縫線位置切取梗死區(qū)心肌，脫水、包埋后行石蠟切片，進行HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu)、普魯士藍鐵染色檢查USPIO位置、熒光成像觀察干細胞分布。

統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，采用t檢驗對標記組和陰性對照組進行細胞活力比較，不同時間點心肌MRI信號強度變化率 (ΔSI)的比較采用單因素方差分析;P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

USPIO標記BMSCs有效性及安全性檢測

普魯士藍染色:顯微鏡下可見細胞內(nèi)有大量藍染顆粒，部分聚集成團，顆粒分布以核周和靠近細胞膜處較為明顯;偶見標記陰性的細胞。細胞平均染色率為99%。

電鏡檢查:透射電鏡觀察標記細胞，可見核膜完整、核仁清晰，胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富、可見黑色顆粒USPIO多位于各級溶酶體內(nèi)。

臺盼藍拒染實驗:于顯微鏡下可見死細胞被均勻染成藍色，標記組和陰性對照組活細胞率差異無統(tǒng)計學意義 (95.7% 比96.3%，P＞0.05)。

在體磁共振成像 實驗組8只F344大鼠心臟磁共振成像顯示左右心室結(jié)構(gòu)清晰，在左心室前壁可見信號減低區(qū) (圖1)，不同時間點 (1 d、1周、2周和4周)該區(qū)域心臟信號減低區(qū)的信號強度變化率 (ΔSI)分別為 71.77±5.32、69.60±3.16、68.90±6.56和68.00±5.76，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.66)。對照組2只F344大鼠心臟磁共振成像顯示左右心室結(jié)構(gòu)清晰，心臟收縮運動協(xié)調(diào)，心肌信號均勻，未見明顯信號減低或增高區(qū)域。

在體及離體光學成像 F344大鼠 (實驗組和對照組)在體熒光成像未檢測到心臟區(qū)域有熒光信號，鼠皮毛產(chǎn)生較高的背景熒光干擾。將心臟取出后，置于與在體熒光成像同樣的激發(fā)光和發(fā)射光條件下進行光學成像，實驗組大鼠心臟在干細胞注射部位可以觀察到微弱的熒光 (圖2)。

病理組織學檢查結(jié)果

HE染色:正常心肌組織結(jié)構(gòu)完整;局部心肌HE染色顯示細胞輪廓雖然存在，但是細胞核消失，符合心肌梗死病理表現(xiàn)，其周圍可見細胞核密度明顯增加，考慮為移植干細胞。

普魯士藍染色:HE染色中考慮為干細胞聚集區(qū)域的部位存在大量藍染顆粒沉積，其余心肌組織內(nèi)未見明顯藍染顆粒分布 (圖3)。

圖1 細胞移植后不同時間大鼠心臟磁共振成像結(jié)果 (快速擾相梯度回波序列，短軸兩腔心圖像)Fig 1 Magnetic resonance imaging results of rat heart over time after cellular transplantation(fast spoiled gradient echo sequence，shortaxis image)

圖2 離體心臟熒光成像Fig 2 In vitro fluorescence imaging of rat heart

熒光成像:普魯士藍染色藍染顆粒分布區(qū)域可見紅色熒光蛋白聚集，其余心肌組織內(nèi)未見明顯紅色熒光蛋白分布 (圖3)。

討 論

本研究將磁共振-光學雙標的BMSCs干細胞注射至急性心肌梗死F344大鼠的梗死心肌周圍，并對其進行在體和離體的磁共振成像、光學成像，結(jié)果顯示磁共振可以實現(xiàn)對移植干細胞進行在體成像示蹤，而光學成像在體成像結(jié)果陰性，離體成像于細胞注射部位可以獲得一定程度的熒光成像。

國內(nèi)外文獻中，有關(guān)大鼠心臟MRI的研究多在小動物專用磁共振成像設(shè)備上進行，磁場強度達4.7T、7T甚至更高，配合小動物專用的心電、呼吸門控設(shè)備，可以獲得質(zhì)量很高的大鼠或小鼠的心臟磁共振圖像［5］。本研究參照文獻 ［6］，利用臨床型1.5T磁共振設(shè)備進行F344大鼠心臟磁共振成像，經(jīng)過初步實驗，本研究基本掌握了大鼠心臟磁共振成像的技術(shù)，為今后進一步深入研究打下基礎(chǔ)。

圖3 4周時大鼠心臟普魯士藍染色 (×200)(A)和熒光成像 (×400)(B)Fig 3 Prussian-blue staining(×200)(A)and fluorescence imaging(×400)(B)of the rat heart on week 4

本研究通過計算SI變化率觀察雙標BMSCs移植后心肌信號強度隨時間的變化，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長 (4周內(nèi))，SI并未發(fā)生統(tǒng)計學變化。文獻報道USPIO/SPIO標記的干細胞凋亡后殘留的鐵顆粒會留下偽影［7］。另外，Zhang等［8］的研究指出巨噬細胞中存在一定量殘留的SPIO顆粒并停留在心肌部位。這些殘留的鐵顆粒成為一個假陽性信號，對利用MRI長期在體示蹤干細胞帶來一定的干擾。本研究選用USPIO-RFP雙標干細胞，是為了克服磁共振成像假陽性的缺陷，相互印證，提高干細胞移植后在體監(jiān)測的準確性。

以在體光學成像為基礎(chǔ)的小動物實驗研究已有不少，但這些研究所利用的小動物模型多為小鼠或裸鼠，涉及大鼠的也多是皮下在體成像，其中結(jié)合MRI技術(shù)進行的雙模態(tài)成像相對更少［9］。本研究采用大鼠模型進行心臟在體光學成像，經(jīng)驗少、難度大，雖然最終未能獲得理想的在體熒光圖像，但是仍然有不少收獲。根據(jù)本研究體外對標記細胞的熒光強度檢測結(jié)果及光信號的衰減規(guī)律，如果注入體內(nèi)的熒光基團距體表深度為1cm，要達成近似體外成像的效果，注入的細胞數(shù)至少要達到107，然而實際顯示，此濃度的細胞液幾乎無法制成單細胞懸液，無法通過注射移植。組織深度對光學信號的影響很大，并且激發(fā)熒光成像的方法存在兩次衰減，對熒光基團的信號強度要求較高。因此，筆者認為可從以下方面對實驗進行進一步改進:(1)提高光學標記細胞的效率或選擇熒光強度更強的熒光基團:提高內(nèi)源性試劑如RFP在細胞中的表達效率可以獲得更強的熒光信號，另外，新型的RFP正在不斷地被篩選出來，如mCherry，Katushka等紅色熒光蛋白被報道有著更強的熒光強度和更接近于近紅外光波段的發(fā)射光波長［10］，對于在體熒光成像相對于普通的RFP有著更大的優(yōu)勢;(2)可以嘗試用螢火蟲熒光素酶的在體生物發(fā)光成像:以螢火蟲熒光素酶為光學信號標記干細胞進行在體示蹤的文獻報道雖然多以小鼠模型為基礎(chǔ)［8，11］，但從理論上，在體生物發(fā)光只需要經(jīng)過一次組織的衰減作用，與熒光成像相比有一定優(yōu)勢。

本研究是對雙模態(tài)成像在體示蹤干細胞的初步探索，尚存在一定的不足。首先，動物數(shù)量少，分組情況有待進一步細化;其次，隨訪觀察時間尚較短，未能對USPIO標記的遠期示蹤效果進行評估;再次，缺少對干細胞治療效果的短期和長期研究，在接下來的研究中可以通過測定心功能的變化，對病理切片進行定量分析，評估干細胞治療的效果和分化情況。

綜上，USPIO-RFP雙標F344大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞注射急性梗死心肌周圍后，磁共振成像可以實現(xiàn)對雙標干細胞的在體示蹤，離體光學成像和病理分析亦可以實現(xiàn)對雙標干細胞的示蹤，而在體光學成像示蹤雙標干細胞有待進一步探索。

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