韓瑞梅，李南方，嚴(yán)治濤，郭艷英，張菊紅，王紅梅，洪 靜，周 玲

1新疆醫(yī)科大學(xué) 研究生院，烏魯木齊 830054

2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓診療研究中心 新疆高血壓診療研究中心，烏魯木齊 830000

前列腺六次跨膜蛋白-2(six transmembrance protein of prostate 2，STAMP2)(又稱為腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的脂肪相關(guān)蛋白或者前列腺六次跨膜上皮抗原-4)屬于前列腺六次跨膜上皮抗原家族成員之一［1］，在內(nèi)臟脂肪組織高度表達(dá)，存在于脂肪細(xì)胞的跨膜蛋白，在脂肪形成重塑時(shí)其以劑量-時(shí)間依賴模式被腫瘤壞死因子-α 誘導(dǎo)［2］。Wellen 等［3］發(fā)現(xiàn)在維持脂肪細(xì)胞功能和全身代謝過程中，STAMP2聯(lián)系著炎癥和飲食因素，STAMP2的表達(dá)對于胰島素信號通路是必需的。STAMP2基因敲除鼠在正常飲食條件下，自發(fā)的發(fā)生代謝性疾病，表現(xiàn)為葡萄糖耐量降低、脂質(zhì)異常、脂肪肝和炎癥與氧化應(yīng)激，STAMP2基因隨脂肪細(xì)胞分化成熟表達(dá)逐漸下調(diào)，可促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化成熟和脂質(zhì)積聚，與肥胖和胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)。Arner等［4］報(bào)道人脂肪組織中STAMP2的表達(dá)與胰島素抵抗和肥胖有關(guān)。因此，從功能上可以說STAMP2基因是2型糖尿病的候選基因。目前，關(guān)于STAMP2基因多態(tài)性與維吾爾族糖尿病的關(guān)聯(lián)研究報(bào)道較少，因此，本研究通過測序法篩查STAMP2基因變異位點(diǎn)，在確定基因代表性變異位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用TaqMan-PCR技術(shù)在維吾爾族自然人群中進(jìn)行基因分型，分析其與維吾爾族糖尿病的相關(guān)性，從遺傳學(xué)角度探討糖尿病和胰島素抵抗的易感機(jī)制，以期為今后糖尿病的防治奠定一定的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

對象和方法

對象 1838例來自2007年1至2月新疆和田地區(qū)維吾爾族人肥胖、高血壓、糖尿病、血脂紊亂的橫斷面調(diào)查研究人群［5］，其中男性694例、女性1144例，年齡 (51.2±10.7)歲。所有受試者均生活在相對隔離地區(qū)，3代無異族通婚及近親結(jié)婚。根據(jù)1999年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)會(huì)制訂的2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)建議，將研究對象分為2組，糖尿病組:274例，男性114例、女性160例，空腹血糖≥7.0 mmol/L或隨機(jī)血糖≥11.0 mmol/L或既往已經(jīng)診斷為糖尿病的患者;對照組:1564例，男性580例、女性984例，空腹血糖≤5.6 mmol/L且隨機(jī)血糖或餐后2 h血糖≤7.8 mmol/L的個(gè)體為對照。同時(shí)排除正在服用降糖或影響血糖水平藥物的病例，以及繼發(fā)性高血壓、惡性腫瘤、服用避孕藥者、肝腎疾病及甲狀腺疾病者，以上兩組資料性別比例匹配。本研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對象均取得知情同意。

方法 體格檢查及生化檢測測定身高、體重、腹圍、血壓等。在受試者知情并同意的情況下，空腹自肘靜脈抽取靜脈血10 ml，離心處理，－70℃保存。葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖 (fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，放射免疫法測定空腹血胰島素 (fasting insulin，F(xiàn)INS)，穩(wěn)態(tài)模型評估法 (homeostasis model of assessment，HOMA)計(jì)算胰島素抵抗 (insulin resistance，IR)指數(shù) (HOMA-IR=FBG×FINS/22.5)，β細(xì)胞功能指數(shù) (HOMA-B)以HOMA-B=20×FINS/(FBG-3.5)評估。

基因組DNA提取 所有被調(diào)查者留取血細(xì)胞5 ml，應(yīng)用試劑盒 (PAXgene blood DNA kit，A QIAGEN/BD Company)提取人血白細(xì)胞DNA，使用分光光度儀(貝克曼公司，美國)測定DNA濃度及純度，DNA溶于緩沖溶液－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

STAMP2基因篩查及代表性位點(diǎn)的基因型鑒定 選取48例 (男性24例、女性24例)無親緣關(guān)系的維吾爾族糖尿病患者樣本，對STAMP2基因的所有外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)、5’和3’非編碼區(qū)～1kb序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序分析 (BigDye3.1測序試劑，加利福尼亞，美國)，以NT_007933.14為參考核酸序列。從測序發(fā)現(xiàn)的變異中，考慮可能的功能 (錯(cuò)義突變)和連鎖不平衡關(guān)系 (r2＞0.8)后選擇最小等位基因頻率 (minor allele frequency，MAF)＞5%的常見變異位點(diǎn)和低頻率的錯(cuò)義突變，應(yīng)用TaqMan-PCR(ABI PRISM 7900HT，UK)技術(shù)在大樣本自然人群中進(jìn)行基因型鑒定。引物及探針由美國ABI公司設(shè)計(jì)并合成。PCR反應(yīng)體系:Master Mix 2.25 μl，引物 0.125 μl，DAN 1.0 μl，加去離子水至5 μl。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，43個(gè)循環(huán) (95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min)，最后72℃延伸7 min。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料根據(jù)是否正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)及均數(shù)的95%可信區(qū)間表示，組間一般資料的比較采用t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn);組間基因型頻率分布采用χ2檢驗(yàn)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)及連鎖不平衡用SNPAlyze 7.0專業(yè)版 (DYNACOM Co.Ltd.，Mobara，Japan)軟件完成;采用多元線性回歸控制年齡、性別、吸煙和飲酒影響后比較不同基因型間血糖水平、胰島素、HOMA指數(shù)等指標(biāo)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

臨床資料比較 糖尿病組和對照組年齡、體重指數(shù)、腹圍、血壓及飲酒差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，但性別比例和吸煙差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表1)。

STAMP2基因功能區(qū)測序結(jié)果 48例維吾爾族糖尿病患者中STAMP2基因功能區(qū)測序共發(fā)現(xiàn)16個(gè)變異位點(diǎn)，內(nèi)含子區(qū)7個(gè)，外顯子區(qū)3個(gè)，3'非翻譯區(qū)6個(gè) (表2)。6個(gè)單核苷酸多態(tài)性在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中已有記錄，10個(gè)變異位點(diǎn)為此次研究新發(fā)現(xiàn)。在最小等位基因頻率＞5%的8個(gè)常見變異中，根據(jù)連鎖不平衡關(guān)系 (r2＞0.8)選取7414G/A(rs8122)、224A/G(rs1981529、Gly75Asp)、364G/A(rs34741656、Ala122Thr)和6031T/G(新發(fā)現(xiàn))作為代表性變異位點(diǎn)，其中6031T/G(新發(fā)現(xiàn))分型失敗。

STAMP2基因代表性變異基因型頻率的分布STAMP2基因的3個(gè)變異位點(diǎn)在各組的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律 (P＞0.05)。在總?cè)巳褐?，rs8122位點(diǎn)基因型頻率在對照組與糖尿病組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.05)，而在總體及按性別分層中，rs1981529和rs34741656位點(diǎn)基因型分布頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表3)。

STAMP2基因rs8122變異不同基因型組間糖尿病表型資料 在總?cè)巳褐胁煌蛐徒M間空腹胰島素及在女性不同基因型組間HOMA指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，但在校正P值后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。在男性人群中，STAMP2基因rs8122變異不同基因型組間各項(xiàng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)(表4)。

STAMP2基因多態(tài)位點(diǎn)單體型分析 3個(gè)常見變異位點(diǎn)rs8122、rs1981529和rs34741656共構(gòu)建了6個(gè)單體型，其中頻率＞9%的4個(gè)常見單體型解釋了糖尿病組所有單體型99.57%的作用，兩組間各單體型構(gòu)成比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.216)(表5)。

表1 臨床資料在對照組和T2DM組間的比較Table 1 Basic characteristics of subjects in T2DM group and control group

表2 48例維吾爾族糖尿病患者STAMP2基因功能區(qū)測序結(jié)果Table 2 Identified polymorphisms of the STAMP2 gene in 48 Uygur subjects with T2DM

表3 STAMP2基因rs1981529、rs34741656、rs8122變異在T2DM組和對照組中的基因型頻率分布(%)Table 3 Genotype distributions of rs1981529，rs34741656，and rs8122 polymorphism in T2DM group and control group(%)

討 論

STAMP2是一種腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的脂肪組織相關(guān)蛋白，受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)［6-8］，與代謝性疾病密切相關(guān)［3］。前列腺六次跨膜上皮抗原-4基因敲除動(dòng)物內(nèi)臟脂肪組織中炎癥因子表達(dá)明顯增高，機(jī)體表現(xiàn)出明顯的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激改變，進(jìn)一步導(dǎo)致胰島素抵抗、葡萄糖代謝障礙等一系列代謝障礙［3］。為此，本研究觀察了STAMP2基因變異與糖尿病的關(guān)系，以探討糖尿病、胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制。

本研究共篩查出16個(gè)STAMP2基因的變異位點(diǎn)，其中10個(gè)位點(diǎn)首次發(fā)現(xiàn)，一定程度上證實(shí)了STAMP2基因種族特異性，不同民族具有特異的突變位點(diǎn)。本研究選擇3個(gè)代表性SNP在研究人群中進(jìn)行基因型鑒定并進(jìn)行病例-對照關(guān)聯(lián)研究，在總?cè)巳褐?，rs8122位點(diǎn)基因型頻率在對照組與糖尿病組間的差異為“臨界”，為進(jìn)一步探討rs8122變異與糖尿病的關(guān)系，比較了rs8122變異不同基因型組間糖尿病的相關(guān)表型資料 (空腹血糖、2h血糖、空腹胰島素、HOMA指數(shù)、HOMA-B)，發(fā)現(xiàn)在總?cè)巳褐胁煌蛐徒M間空腹胰島素及在女性不同基因型組間HOMA指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在校正P值后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過不同角度、不同層面的分析，反映了STAMP2基因rs8122、rs1981529和rs34741656變異與維吾爾族糖尿病不相關(guān)。

表4 糖尿病相關(guān)數(shù)量性狀在STAMP2基因rs8122不同基因型間的比較Table 4 Comparison of diabetes quantitative phenotypes among rs8122 genotypes of STAMP2 polymorphisms in Uygur population

表5 T2DM組和對照組STAMP2基因單體型頻率比較Table 5 Comparison of haplotype frequency of STAMP2 polymorphism between T2DM group and control group

本研究首次在小樣本新疆維吾爾糖尿病人群中篩查STAMP2基因功能區(qū)的所有變異位點(diǎn)，選擇代表性變異位點(diǎn)在大樣本人群中進(jìn)行基因型鑒定而開展的病例-對照研究。本研究采用這種研究策略主要基于以下幾點(diǎn):(1)研究人群為新疆維吾爾族，為糖尿病高發(fā)民族，而NCBI數(shù)據(jù)庫中無維吾爾族相關(guān)遺傳信息，如果按照數(shù)據(jù)庫中其他民族的信息選取SNP，必定會(huì)存在誤差，同時(shí)會(huì)錯(cuò)失該民族某些特異性位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，以便發(fā)現(xiàn)該民族特異性、新的變異位點(diǎn)。(2)小樣本篩查變異，大樣本驗(yàn)證的關(guān)聯(lián)研究，相對于大樣本測序研究可以大大節(jié)省研究費(fèi)用。選取新疆維吾爾族人群中開展此項(xiàng)研究主要是由于:(1)既往的流行病學(xué)調(diào)查顯示，新疆維吾爾族是代謝性疾病的高發(fā)民族，明顯高于同地區(qū)的其他民族［5，9-10］，同時(shí)有研究報(bào)道該民族胰島素抵抗的發(fā)病率非常高［11］;(2)由于文化、宗教、地域、經(jīng)濟(jì)等原因，本研究選擇的和田地區(qū)維吾爾族仍保留有大量相對完整的隔離遺傳體系，并且人口相對穩(wěn)定，是遺傳研究寶貴的資源。本研究在小樣本糖尿病人群中共篩查發(fā)現(xiàn)16個(gè)變異位點(diǎn)，其中6個(gè)SNPs在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中已有記錄，10個(gè)變異位點(diǎn)為此次研究新發(fā)現(xiàn)，為該民族在STAMP2基因遺傳數(shù)據(jù)庫提供了更多信息。

本研究尚存在局限性，即未在相同民族的正常人群中進(jìn)行基因測序分析，且本研究的樣本量仍不足以顯著區(qū)分中度效應(yīng)的STAMP2基因多態(tài)位點(diǎn)，因此應(yīng)該進(jìn)一步在其他人群或更大樣本量中重復(fù)驗(yàn)證該研究結(jié)果?；蚪M掃描連鎖分析顯示，7號染色體長臂是2型糖尿病、胰島素抵抗等的易感區(qū)［12-14］，因此，有必要擴(kuò)展STAMP2基因區(qū)域進(jìn)一步研究基因多態(tài)性與糖尿病、胰島素抵抗的關(guān)系。

綜上，本研究通過對STAMP2基因功能區(qū)測序篩選維吾爾族糖尿病患者特異的變異位點(diǎn)進(jìn)行人群關(guān)聯(lián)研究分析，報(bào)道了STAMP2基因rs8122、rs1981529及rs34741656位點(diǎn)多態(tài)性與新疆維吾爾族糖尿病之間的關(guān)聯(lián)研究，研究未顯示STAMP2多態(tài)性與新疆維吾爾族糖尿病相關(guān)，但結(jié)果尚待進(jìn)一步在大樣本、不同種族人群中進(jìn)行驗(yàn)證。

［1］Ohgami RS，Campagna DR，McDonald A，et al.The steap proteins are metalloreductases［J］.Blood，2006，108(4):1388-1394.

［2］Moldes M，Lasnier F，Gauthereau X，et al.Tumor necrosis factor-alpha-induced adipose-related protein(TIARP)，a cell-surface protein that is highly induced by tumor necrosis factor-alpha and adipose conversion［J］.J Biol Chem，2001，276(36):33938-33946.

［3］Wellen KE，F(xiàn)ucho R，Gregor MF，et al.Coordinated regulation of nutrient and inflammatory responses by STAMP2 is essential for metabolic homeostasis［J］.Cell，2007，129(3):537-548.

［4］Arner P，Stenson BM，Dungner E，et al.Expression of six transmembrane protein of prostate 2 in human adipose tissue associates with adiposity and insulin resistance［J］.J Clin Endocrinol Metab，2008，93(6):2249-2254.

［5］Li NF，Wang HM，Yang J，et al.Serum uric acid is associated with metabolic risk factors for cardiovascular disease in the Uygur population［J］.Appl Physiol Nutr Metab，2009，34(6):1032-1039.

［6］Fasshauer M，Klein J，Krahlisch S，et al.GH is a positive regulator of tumor necrosis factor alpha-induced adipose related protein in 3T3-L1 adipocytes［J］.J Endocrinol，2003，178(3):523-531.

［7］Fasshauer M，Kralisch S，Klier M，et al.Interleukin-6 is a positive regulator of tumor necrosis factor alpha-induced adipose-related protein in 3T3-L1 adipocytes［J］.FEBS Lett，2004，560(1-3):153-157.

［8］Kralisch S，Sommer G，Weise S，et al.Interleukin-1beta is a positive regulator of TIARP/STAMP2 gene and protein expression in adipocytes in vitro［J］.FEBS Lett，2009，583(7):1196-1200.

［9］郭艷英，王坤，趙雷，等.新疆博爾塔拉蒙古自治州維、哈、蒙、漢四民族代謝綜合征流行病學(xué)調(diào)查 ［J］.中華內(nèi)科雜志，2006，45(3):227-228.

［10］祁燕，謝自敬，阿不力克木.烏魯木齊市維吾爾族成年人代謝綜合征流行病學(xué)調(diào)查 ［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2004，14(19):155-156.

［11］王薇彬，李云，謝自敬，等.烏魯木齊市維吾爾族居民1002人糖、脂代謝紊亂與胰島素抵抗的關(guān)系 ［J］.中國臨床康復(fù)，2004，8(33):7418-7419.

［12］Hanson RL，Ehm MG，Pettitt DJ，et al.An autosomal genomic scan for loci linked to typeⅡdiabetes mellitus and body-mass index in Pima India ［J］.Am J Hum Genet，1998，63(4):1130-1138.

［13］Cheng LS，Davis RC，Raffel LJ，et al.Coincident linkage of fasting plasma insulin and blood pressure to chromosome 7q in hypertensive Hispanic families ［J］.Circulation，2001，104(11):1255-1260.

［14］Manolio TA，Brooks LD，Collins FS.A hapmap harvest of insights into the genetics of common disease［J］.J Clin Invest，2008，118(5):1590-1605.