尹曉艷 閆春芳 孫斌

甲狀腺相關性眼?。╰hyroid-associated ophthalmopathy,TAO）是一種與多種因素相關的常見的眼眶疾病[1]，是以眼球后及眶周組織的浸潤性病變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊?是引起成人眼球突出的最常見原因。近些年來，許多國內(nèi)外的專家學者對TAO進行了研究，在發(fā)病機制和診斷方法上，取得了一定的進展，但是由于樣本大小、研究人群以及地域的不同,各研究結論不同。目前普遍認為是遺傳因素、免疫學因素及外界環(huán)境共同作用產(chǎn)生。國內(nèi)外研究表明,基因的多態(tài)性可能與TAO的發(fā)病有關。由于TAO常伴隨GD發(fā)生，很多患者血清促甲狀腺素受體抗體（anti-thyrotropin receptor antibody,TRAb）含量增高[2]，因此促甲狀腺素受體（TSHR）成為TAO自身抗原的研究首選。然而，TSHR與TAO的作用機制還不是很明確。目前國內(nèi)外尚未見TAO和TSHR多態(tài)性關系的文獻報道。本研究旨在探討TSHR基因與TAO的關系，并采用PCR-RFLP方法研究TSHR基因D727E多態(tài)性與TAO的關系，為TAO的預防及治療提供重要的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TAO組：51例，男20例，女31例；年齡9～65歲，平均（39.98±14.84）歲。病程1月～19年，平均（1.69±3.19）年，樣本均來自山西醫(yī)科大學第一及第三醫(yī)院眼科確診的患者，納入標準為1979年美國甲狀腺協(xié)會(American Thyroid Association,ATA)制定的診斷及分級標準[3]，患者均經(jīng)甲狀腺功能測定、眼部B超或CT檢查排除了其他疾病所導致的突眼,并且有專人測量其雙眼突出度[4]；GD組：55例，男24例，女31例;年齡13～78歲，平均（34.33±9.501）歲。病程1月～11年，平均（2.83±4.21）年，納入標準為《內(nèi)科學》第7版Graves病[5]。CON組：60例，男24例，女36例，年齡12～76歲，平均（41.67±10.36）歲，為山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院健康體檢中心篩選的無自身免疫性及感染性疾病的健康人群，年齡、性別與病例組相匹配。所有患者及健康對照者均為山西地區(qū)漢族人，并簽署了知情同意書。

1.2 臨床檢查 一般檢查：包括詳細詢問病史及全身體檢。

眼部常規(guī)檢查：包括視力、外眼、屈光系統(tǒng)、眼底和眼球運動。眼球突出度檢查采用Hertel突眼計檢查。根據(jù)我國正常人眼球突出度標準：雙眼球或單眼球突出度>14mm，或雙眼球突出度相差≥2mm者，為眼球突出（除外生理性或假性突出）。用復視圖檢查分析眼外肌功能。部分患者行眼眶CT、B超檢查，分析眼外肌、視神經(jīng)及眶內(nèi)病變狀況，以協(xié)助診斷。

1.3 TSHR D727E多態(tài)性研究方法 （1）基因提取 抽取空腹靜脈血2ml，EDTA-K2抗凝，用飽和酚-氯仿三步法提取外周血DNA。（2）引物合成 引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。上游引物：5’-CCATTCCTCTATGCTATTTTCAC-3’；下游引物：5’-CCGTTTGCATATACTCTTCTG-3’[6]。（3）PCR擴增反應 反應體系40ul，由8ul基因組DNA，4ul 10×Buffer，0.8ul 10×dNTP，3.2ul 25mmol/L MgCl2，0.06ul上游引物，0.06ul下游引物，0.32ulTaq酶，24ul去離子水組成。循環(huán)參數(shù)：94℃預變性5min，94℃變性45s，61.6℃退火45s，72℃延伸45s，循環(huán)35次，72℃終末延伸10 min。目的基因片段長度為265bp。（4）酶切：擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NlaⅢ酶切后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在紫外透射儀下觀察條帶。

1.4 統(tǒng)計學方法 運用Hardy-Weinberg平衡法則檢驗樣本的群體代表性。用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析各組等位基因和基因型頻率，組間比較用χ2檢驗，顯著性檢驗水準а=0.05。

2 結果

2.1 TSHR D727E位點酶切產(chǎn)物電泳結果 TSHR D727E位點野生型（CC）片段為160bp、84bp和21bp 3個片段；純合變異型（GG）片段為181bp和84bp 2個片段；雜合變異型（GC）片段為181bp、160bp、21bp和84bp 4個片段，如圖1。

圖1 TSHR D727E位點酶切產(chǎn)物電泳結果。M:marker;4、5、6、7野生型CC;3純合變異型GG;1、2、8、9雜合變異型GC。

2.2 TSHR D727E位點等位基因頻率與基因型的分布 G等位基因頻率：TAO組（28.4%）GD組（15.5%）CON組（5.8%），χ2=21.020，а=0.000<0.05，表明G等位基因頻率三組之間有差異。兩兩比較，TAO組與GD組，χ2=5.246，а=0.022<0.05；TAO組與CON組，χ2=20.723，а=0.000<0.05；GD組與CON組，χ2=5.684，а=0.017<0.05。表明此三組兩兩之間G等位基因頻率差異均有統(tǒng)計學意義，TAO組G等位基因頻率（28.4%）明顯高于GD組（15.5%）及正常對照組（5.8%）；GD組G等位基因頻率（15.5%）明顯高于正常對照組（5.8%）。

GG+GC基因型頻率：TAO組(47.1%)GD組(25.5%)CON組(10.0%)，χ2=19.482，а=0.000<0.05，表明GG+GC基因型頻率三組之間有差異。兩兩比較，TAO組與GD組，χ2=5.371，а=0.020<0.05；TAO組與CON組，χ2=19.196，а=0.000<0.05；GD組與CON組，χ2=4.771，а=0.029<0.05。表明此三組兩兩之間GG+GC基因型頻率差異均有統(tǒng)計學意義，TAO組GG+GC基因型頻率（47.1%）明顯高于GD組(25.5%)及正常對照組（10.0%）；GD組GG+GC基因型頻率(25.5%)明顯高于正常對照組（10.0%），如表1。

表1 TSHR D727E基因型及等位基因頻率分布

3 討論

TSHR是一種跨膜性蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，體內(nèi)主要分布在甲狀腺濾泡細胞膜上[7]。研究表明TSHR是許多自身免疫性甲狀腺疾病(auto immune thyrod disease,AITD)主要的自身抗原之一。在生理狀態(tài)下，促甲狀腺素(TSH)通過TSHR而影響甲狀腺細胞的生長、分化和功能的發(fā)揮。病理狀況下，TSHR又是TRAb攻擊的靶，是引起甲狀腺機能亢進(甲亢)的自身抗原[8]。TSHR的主要功能為與TSH結合，通過腺苷酸環(huán)化酶- cAMP途徑發(fā)揮生理作用。若編碼TSHR的序列發(fā)生了變異，可引起TSHR蛋白結構和免疫源性改變，導致自身抗體產(chǎn)生，包括針對甲狀腺刺激性(TSAb)或阻斷性(TBAb)等抗體。在GD時,TSAb可抑制Fas在TEC的表達,從而抑制Fas/FasL引起的TEC凋亡,參與GD甲狀腺腫的形成[9]。但TBAb的產(chǎn)生是否與TSHR基因突變有關的問題頗有爭議,仍需要進一步的研究[10]。

編碼人TSHR的基因位于14號染色體長臂(14q13)，全長超過60kb，約含58000堿基對，有10個外顯子，9個內(nèi)含子。第1至第9外顯子編碼TSHR的細胞外功能區(qū)，而跨膜區(qū)及細胞內(nèi)區(qū)則由單個巨大的始基型第10個外顯子編碼[11]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)TSHR基因上膜內(nèi)區(qū)的D727E(Asp-Glu)的改變與GD相關，但各家報道的結論相去甚遠。目前國內(nèi)外尚未見TAO和TSHR多態(tài)性關系的文獻報道。

本研究以TSHR為候選基因，采用PCR-RFLP方法探討TSHR基因D727E多態(tài)性與山西地區(qū)部分漢族人TAO易感性的關系。其結果顯示：G等位基因頻率及GG+GC基因型頻率三組之間有差異，此三組兩兩之間差異均有統(tǒng)計學意義，TAO組G等位基因頻率及GG+GC基因型頻率明顯高于GD組及正常對照組；GD組G等位基因頻率及GG+GC基因型頻率明顯高于正常對照組。表明TSHR基因D727E位點的G等位基因與TAO及GD的發(fā)生相關。由此，從基因?qū)W的角度我們支持TSHR是甲狀腺和眼眶受累組織共同抗原的學說。此結果與梁軍等人研究結論不一致[12]，他們認為漢族人TSHR受體基因與GD無相關性。

目前不同研究中存在的許多不一致現(xiàn)象，可能是由于遺傳易感因素的異質(zhì)性造成的。通過對不同群體的基因型-表現(xiàn)型相關性分析，可揭示遺傳異質(zhì)性在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。因此有很多的問題尚需我們進一步探討、研究和改進。

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