葉麗萍，王春玲，王春鳳

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林省永吉縣畜牧局黃榆鄉(xiāng)畜牧站，吉林 永吉 132223）

乳酸菌為人及動物體內(nèi)正常菌群的重要成員，主要定植在黏膜表面，刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)對調(diào)整菌群平衡起重要作用。乳酸菌能刺激機(jī)體SIgA的細(xì)胞增殖，使SIgA水平上升，從而使機(jī)體對RV產(chǎn)生免疫應(yīng)答，緩和RV引起的腹瀉。乳酸菌已作為一種新型表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了多種外源基因，但由于乳酸菌屬革蘭陽性菌，應(yīng)用氯化鈣轉(zhuǎn)化法所獲得的轉(zhuǎn)化子較少，轉(zhuǎn)化效率較低，而用電轉(zhuǎn)化方法可使細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率達(dá)到109～1010轉(zhuǎn)化子／μg閉環(huán)DNA［1］。本文以嗜酸乳桿菌作為受體菌株，將豬源A組輪狀病毒pW425et-Vp4重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入嗜酸乳桿菌，對影響電轉(zhuǎn)化效率的各因素進(jìn)行研究，確立提高轉(zhuǎn)化效率的最佳條件，并對pW425et-Vp4乳酸菌進(jìn)行反應(yīng)原性分析，為豬源A組輪狀病毒Vp4基因工程乳酸菌疫苗的大量制備及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 嗜酸乳桿菌，為本實(shí)驗(yàn)室保存；豬源A組輪狀病毒pW425et-Vp4重組質(zhì)粒，為大腸桿菌-乳酸菌穿梭質(zhì)粒由本人構(gòu)建。

1.2 試劑 MRS液體培養(yǎng)基用冰醋酸調(diào)pH值至6.0～6.2，115℃高壓滅菌20min；取100mL MRS液體培養(yǎng)基加入2%～3%瓊脂粉，115℃高壓滅菌20min制備 MRS固體培養(yǎng)基；PBS緩沖液用HCl調(diào)pH值至7.4，加水定容至1L，高壓滅菌20min，室溫保存；PEB電擊緩沖液115℃高壓滅菌保存。輪狀病毒兔抗豬多克隆抗體由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室研制保存；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，購自寶生物工程（大連）有限公司；SalⅠ、KpnⅠ、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)為TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Spanish公司產(chǎn)品；PVDF轉(zhuǎn)移膜為Gleman公司產(chǎn)品。

1.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備 MRS培養(yǎng)平板上挑取單個(gè)嗜酸乳桿菌菌落接種于5mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧過夜培養(yǎng)；過夜培養(yǎng)物以2%接種量接入20mL MRS培養(yǎng)液中，同時(shí)分別加入1%甘氨酸或0.3mol／L蔗糖或1%甘氨酸+0.3mol／L蔗糖；37℃靜置厭氧培養(yǎng)4h左右，摸索乳酸菌不同生長時(shí)期及培養(yǎng)基成分對電轉(zhuǎn)化效率的影響；將生長到最佳時(shí)期的乳酸菌，0℃～／min離心10min收集沉淀；冰冷的PEB電擊緩沖液懸浮沉淀，0℃～／min離心5min洗細(xì)胞2次；沉淀懸浮于500 μL冰冷的電擊緩沖液中，備用。

1.4 pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的構(gòu)建 取5～10μL pW425et-Vp4重組質(zhì)粒加入到200μL冰冷的乳酸菌感受態(tài)中混勻，冰浴5min，移入預(yù)冷的電擊杯中（內(nèi)徑0.2cm），冰上靜止5min，優(yōu)化電場強(qiáng)度及脈沖時(shí)間。根據(jù)最適條件釋放脈沖，電擊。將電擊混合物移入新的預(yù)冷的Eppendorf管中，冰浴5min，加入500μL含0.3mol／mL蔗糖的MRS培養(yǎng)基，37℃靜置厭氧培養(yǎng)3～4h，取50μL培養(yǎng)物涂布含有紅霉素的MRS平板，37℃靜置厭氧培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù)目，每項(xiàng)條件優(yōu)化做3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.5 乳酸菌重組質(zhì)粒的鑒定與表達(dá) 電轉(zhuǎn)化后的重組質(zhì)粒單菌落接種入5mL含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)12h，按O′Sullivan等［2］的方法進(jìn)行乳酸菌重組質(zhì)粒的提取。經(jīng)PCR、酶切鑒定的陽性質(zhì)粒的單菌落接種入100mL含紅霉素（100μg／mL）的 MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置厭氧培養(yǎng)至OD600為0.60～0.80，每隔1h取1次菌液，取至7h。以同樣的方法誘導(dǎo)含空載體pW425et的乳酸菌作對照。將各個(gè)時(shí)間誘導(dǎo)收獲的菌液OD600均調(diào)至0.60～0.80，取菌液1.4mL，1200r／min離心5min，棄上清。沉淀中加入50 μL電泳液，1×SDS上樣緩沖液50μL（其中含1／10的DTT），沸水煮10min，25℃12000r／min離心10min，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第2版方法進(jìn)行8%SDS-PAGE凝膠電泳及Western-blot分析。

2 結(jié)果

2.1 pW425et-Vp4基因工程乳酸菌構(gòu)建條件的優(yōu)化

2.1.1 細(xì)胞生長時(shí)期及培養(yǎng)基成分對轉(zhuǎn)化效率的影響 固定電場強(qiáng)度為11kV／cm，脈沖時(shí)間為3.8 ms，細(xì)胞的不同生長時(shí)期，培養(yǎng)基的不同成分對重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化效率的影響結(jié)果如圖1所示。當(dāng)感受態(tài)細(xì)胞的OD600值為0.4時(shí)，各試驗(yàn)組的轉(zhuǎn)化效率均達(dá)到了最高值，之后有所下降，所以感受態(tài)的最佳生長時(shí)期為0.4。在MRS培養(yǎng)基中加入1%甘氨酸組及加入1%甘氨酸+0.3mol／L蔗糖組的轉(zhuǎn)化效率較MRS組有所提高，且后者更有利于提高電轉(zhuǎn)化效率，達(dá)3.8×104CFU／μg DNA，但加入0.3 mol／L蔗糖組轉(zhuǎn)化效率較MRS組無明顯變化。

2.1.2 電場強(qiáng)度對轉(zhuǎn)化效率的影響 固定脈沖時(shí)間為3.8ms，改變電場強(qiáng)度進(jìn)行重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率隨電場強(qiáng)度的增加而增加，于11kV／cm時(shí)達(dá)到最大，隨后隨著電場強(qiáng)度的增加轉(zhuǎn)化效率下降（圖2）。

2.3 脈沖時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響 脈沖時(shí)間的長短直接影響電轉(zhuǎn)化效率，脈沖時(shí)間太短不能使DNA分子有效進(jìn)入細(xì)胞，而脈沖時(shí)間過長，細(xì)胞生存率又降低［3］。固定電場強(qiáng)度為11kV／cm，脈沖時(shí)間在3.5～3.9ms區(qū)間轉(zhuǎn)化效率較高，且于3.8ms時(shí)達(dá)到最高，隨后有所下降（圖3）。

2.4 電擊后孵育時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響 電擊使細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞，所以電擊后細(xì)胞要進(jìn)行一段時(shí)間的復(fù)蘇使孔洞復(fù)原。固定電場強(qiáng)度為11kV／cm，脈沖時(shí)間為3.8ms，進(jìn)行重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化。電擊后不同的孵育時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響結(jié)果如圖4所示，細(xì)胞復(fù)蘇3～4h，才能有較好的轉(zhuǎn)化效率，4h以后轉(zhuǎn)化效率提高不明顯。所以試驗(yàn)選擇復(fù)蘇3～4h。

2.5 pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的鑒定與表達(dá)

2.5.1 乳酸菌重組質(zhì)粒的酶切鑒定 將乳酸菌重組質(zhì)粒提取鑒定疑似含有目的片段的1號菌質(zhì)粒進(jìn)行SalⅠ和KpnⅠ酶切鑒定。結(jié)果獲得兩條片段，大片段約為～bp，小片段約為～bp，表明疑似菌株中的重組質(zhì)粒中含有外源基因Vp4，為陽性克隆，見圖5。

圖5 重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.5.2 乳酸菌重組質(zhì)粒的PCR鑒定 以1號菌的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)出與預(yù)期大小相符的目的條帶，見圖6。

圖6 重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.5.3 SDS-PAGE分析 分析上述經(jīng)過鑒定為陽性的克隆菌株1各時(shí)間的表達(dá)情況。由圖7可見Vp4基因獲得了表達(dá)，蛋白質(zhì)的相對分子量約為87 ku的融合蛋白，與預(yù)期Vp4蛋白的分子量一致，而空載體pW425et在乳酸菌受體菌株中則未見該蛋白質(zhì)表達(dá)。

圖7 SDS-PAGE電泳檢測Vp4基因在乳酸菌中的表達(dá)產(chǎn)物

2.5.4 Western-blot分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)移膜上，進(jìn)行蛋白印跡分析，其結(jié)果見圖8。從圖中可見87.0ku處有一條明顯的蛋白印跡帶，說明pW425et-Vp4乳酸菌重組質(zhì)粒表達(dá)蛋白可與豬輪狀病毒多克隆抗體反應(yīng)。

圖8 重組質(zhì)粒pW425et-Vp4乳酸菌表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析

3 討論

電轉(zhuǎn)化（Electro-transformation）是利用瞬間高壓打擊細(xì)胞膜，使之形成孔洞，使DNA分子得以進(jìn)入細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化是提高乳酸菌的轉(zhuǎn)化效率的有效方法，然而影響細(xì)菌電轉(zhuǎn)化效率的因素很多。不同生長時(shí)期收獲的細(xì)胞、電壓、脈沖時(shí)間、電擊后孵育時(shí)間都將影響電轉(zhuǎn)化效率的高低。以嗜酸乳桿菌為豬源A組輪狀病毒pW425et-Vp4重組質(zhì)粒的受體菌株，對影響電轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，當(dāng)感受態(tài)細(xì)胞的OD600值于0.4時(shí)，在MRS培養(yǎng)基中加入1%甘氨酸+0.3mol／L蔗糖，電場強(qiáng)度為11kV／cm，脈沖時(shí)間為3.8ms，電擊后細(xì)胞復(fù)蘇3～4h時(shí)，得到較高的轉(zhuǎn)化效率，最高可達(dá)3.8×104CFU／μg DNA。此外，抗生素濃度、質(zhì)粒DNA濃度、不同的緩沖液的高低也影響電轉(zhuǎn)化效率。抗生素濃度過低不能保證轉(zhuǎn)化子的可靠性起不到篩選作用，而濃度過高則會抑制轉(zhuǎn)化子的生長。DNA分子太少不足以產(chǎn)生高轉(zhuǎn)化效率，而濃度過高，細(xì)胞能吸收的DNA分子過飽和，反而不利于轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)結(jié)果確定紅霉素的最小抑制濃度為100μg／mL，當(dāng)pW425et-Vp4重組質(zhì)粒濃度為200ng／μL時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)3.1×104CFU／μg DNA。

隨著對乳酸菌的研究不斷深入，作為分子生物學(xué)基本手段的轉(zhuǎn)化技術(shù)也將日益受到關(guān)注，目前已經(jīng)在某些乳酸菌中成功表達(dá)了一系列的外源蛋白［4-5］?？梢哉f以乳酸菌作為表達(dá)外源保護(hù)性抗原基因的受體菌株，就可以將乳酸菌的生物學(xué)功能和外源功能抗原基因的特異性免疫相結(jié)合，所以應(yīng)用乳酸菌攜帶外源基因作為黏膜免疫的口服疫苗將具有良好的應(yīng)用前景。pW425et-Vp4乳酸菌陽性克隆經(jīng)Western-blot分析表明，其蛋白具有與輪狀病毒多克隆抗體的反應(yīng)原性，這為pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的大量制備及其免疫原性分析奠定了基礎(chǔ)，也將為后續(xù)試驗(yàn)作好充分準(zhǔn)備。

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