鄭緒陽 李曉偉 馮亞男 黃先玫 杭州市第一人民醫(yī)院兒科 杭州 310006

目前認(rèn)為，動脈粥樣硬化癥不只是老年人的疾病，而是一個小兒時期得病成年發(fā)病的疾病，動脈內(nèi)膜的沉積在小兒即已開始，到血流減少到一定程度才出現(xiàn)缺血的癥狀[1-2]。兒童肥胖是使這個成人疾病年輕化的最危險因素[3-4]。國外諸多研究表明，水通道蛋白7（aquaporin7，AQP-7）表達(dá)異?；蚬δ苷系K是導(dǎo)致肥胖發(fā)生的一個重要原因。Marrades等研究表明肥胖者較體瘦者脂肪組織水通道蛋白7表達(dá)明顯減少。文獻(xiàn)報道，茶多酚具有對抗肥胖和抗動脈粥樣硬化的作用，但機制尚不明確。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3 gallate，EGCG）作為茶葉多酚的有效活性成分之一，在細(xì)胞培養(yǎng)中對血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移具有劑量依賴性抑制作用[4-5]，但在動物體內(nèi)對動脈血管病變作用尚不明確。兒茶素作用的靶器官為脂肪組織、肝臟、睪丸、骨骼肌等，與水通道蛋白7分布器官相似，但兒茶素是否調(diào)節(jié)水通道蛋白7的表達(dá)？兒茶素對血脂的干預(yù)作用是否與水通道蛋白7表達(dá)有關(guān)？目前未見文獻(xiàn)報道。本實驗旨在觀察EGCG對肥胖幼鼠模型動脈病變和動脈組織水通道蛋白7表達(dá)的干預(yù)作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 出生3天Sprague-Dawley（SD）大鼠，♂，SPF級，體質(zhì)量（9.5±0.75）g，由浙江大學(xué)動物中心提供，許可證號：SCXK（浙）2008-0002。所有的操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》，動物在實驗過程中自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.2 主要藥品、試劑及儀器 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）：上?？稻呕び邢薰?，純度＞98%；5×定量PCR buffer：ABI公司，美國；Taq酶（含MgCl2 Buffer）、dNTPs、oligo（dT）15、M-MLV、DEPC、DNA Marker、熒光探針購買自上海生工；TRIzol Reagent：Invitrogen公司，美國。BestBio-貝博cDNA第一鏈合成試劑盒，ABI 3900臺式高通量DNA合成儀，科大創(chuàng)新HC-3018R高速冷凍離心機，ABI 9700 PCR儀，ABI 7500全自動熒光定量PCR儀。

2 實驗方法

2.1 造 模 參照文獻(xiàn)[6]的方法，取出生第3天的雄性新生SD大鼠，隨機分為對照組和模型組，模型組3只一籠，對照組10只一籠，分別由母鼠喂養(yǎng)至21天，斷乳后正常食料喂養(yǎng)至出生后60天。生活環(huán)境為自然光照，溫度18～22℃，相對濕度為50%～60%，自由飲水?dāng)z食。斷乳前除第8、14天給動物稱重，其余時間不予干預(yù)，斷乳后每天定時觀察飲水量、尿量、糞便質(zhì)地和量，記錄飲食量，每周測量體質(zhì)量。

2.2 分 組 將72只大鼠按隨機法分為對照組、模型組、EGCG低劑量組和EGCG高劑量組，每組18只。除對照組外，其他三組按上述方法造模，出生24天后，EGCG低劑量組給予10mg/（kg·d）EGCG灌胃；EGCG高劑量組給予50mg/（kg·d）EGCG灌胃。EGCG用生理鹽水溶解至濃度為1g/L；對照組及模型組按10mL/（kg·d）生理鹽水灌胃。每周稱體質(zhì)量1次并記錄，所有給藥（液）按體質(zhì)量校正。

2.3 標(biāo)本留取及生化指標(biāo)檢測 喂養(yǎng)至生后2個月時，大鼠禁食12h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，稱重，量取從大鼠鼻尖到肛門的長度即體長。計算Lee's指數(shù)3√體質(zhì)量×103/體長（cm）。股動脈采血，3000r/min離心10min，取血清送本院檢驗科用全自動血生化分析儀（日立7170A Automatic Analyzer）檢測血糖、血脂、血胰島素（按放免法測定）等指標(biāo)，并計算胰島素敏感指數(shù)（ISI，即空腹血糖值與空腹血胰島素值乘積的倒數(shù)，取其自然對數(shù)），同時留取睪丸外周和腎臟周圍脂肪組織，生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干，電子天平稱重。計算脂體比=[睪周脂肪重量（g）+腎周脂肪重量（g）]/體質(zhì)量（g）×100。留取腹主動脈2cm，立即放入液氮罐中，并置-70%低溫冰箱保存待測。

2.4 采用熒光定量PCR（FQ-PCR）法檢測AQP7 mRNA表達(dá) 參照NCBI公布Genebank中的DNA、mRNA基因序列，AQP7正義鏈引物、反義鏈引物、熒光探針的序列由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心設(shè)計，采用Primer express 2.0軟件，在ABI 3900臺式高通量DNA合成儀中合成。具體引物和探針的序列如下:AQP7；F：5'-TGGGATGCTCCAGCTGTGTA-3'，R：5'-ACACCCCAAGAACGCAAACA-3'，Probe:5'-FAMCTTCGCCATCACGGACAAGTTGAACA-TAMRA-3'。經(jīng)腹主動脈組織RNA的提取和鑒定，采用 PE 9600 PCR基因擴(kuò)增儀（美國 Perkin Elmer公司）做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA，進(jìn)行熒光定量 PCR（FQ-PCR）反應(yīng)，陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品及樣本均按以下反應(yīng)體系進(jìn)行：5×定量PCR buffer10μL，上游引物F（25μmol/L）1μL，下游引物 R（25μm）1μL，dNTPs（10mmol/L）0.5μL，熒光探針（20μmol/L）1μL，Taq酶1.5μL，cDNA 5μL，ddH2O 30μL。反應(yīng)條件為:93%3min，然后 93%30s，55%45s，共 40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動分析并繪出陽性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t檢驗或方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 EGCG對肥胖幼鼠動脈病變的影響 正常對照組大鼠腹主動脈手指觸摸未見異常，模型組大鼠血管彈性似有下降。HE染色光鏡下觀察，正常對照組層次清晰，內(nèi)膜薄，光滑完整，中膜平滑肌細(xì)胞與彈力纖維走向一致（見圖1）；模型組大鼠血管均可見腹主動脈內(nèi)膜增厚、纖維化，內(nèi)膜與中膜間可見一長梭形斑塊，血管壁向管腔內(nèi)突出，內(nèi)膜及中膜內(nèi)有散在性鈣化灶，可見泡沫細(xì)胞，并見中膜平滑肌細(xì)胞增多、排列紊亂、核深染，其長軸垂直于彈力纖維（見圖2）；EGCG低劑量組見大鼠腹主動脈中膜平滑肌細(xì)胞減少，代之以較多泡沫細(xì)胞，但鈣化灶不明顯，未見梭形斑塊（見圖3）；EGCG高劑量組見腹主動脈壁層次尚清晰，可見內(nèi)皮細(xì)胞，中層平滑肌層無萎縮、均勻，厚度尚正常，外層為疏松結(jié)締組織（見圖4）。

3.2 各組腹主動脈和脂肪組織AQP-7mRNA表達(dá)量比較 模型組腹主動脈和脂肪組織AQP-7mRNA表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.01），EGCG高劑量組腹主動脈和脂肪組織AQP-7mRNA表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.01），見表1。

4 討論

70%的動脈粥樣硬化與肥胖有關(guān)。本研究通過過度喂養(yǎng)建立食餌性肥胖幼鼠模型，與Boullu-Cioc-ca等報道相一致[5]，同時已證實其模型存在動脈粥樣硬化早期病變[6]。

表1 各組腹主動脈和脂肪組織AQP-7mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組腹主動脈和脂肪組織AQP-7mRNA表達(dá)水平比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別n/只腹主動脈脂肪組織對照組模型組EGCG低劑量組EGCG高劑量組18 18 18 18 1.13±0.77 3.86±1.64**3.11±1.51 2.07±0.82▲▲3.36±1.30 14.98±5.26**10.28±3.22▲7.08±2.68▲▲

本研究表明，SD幼鼠腎周和附睪脂肪組織和腹主動脈均存在AQP7表達(dá)，肥胖幼鼠模型的脂肪組織和腹主動脈壁AQP7表達(dá)明顯上調(diào)。既往研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白7不僅存在于脂肪組織，還存在于腎小管、腸道上皮細(xì)胞以及睪丸、心臟和橫紋肌的毛細(xì)血管壁上，其在血管壁上表達(dá)報道尚少。本研究證實大鼠腹主動脈血管壁上亦存在AQP7，肥胖幼鼠模型動脈組織內(nèi)其表達(dá)上調(diào)，可能與動脈粥樣病變后，動脈內(nèi)膜內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞和鈣化灶，血管內(nèi)膜損傷后引起平滑肌細(xì)胞增殖遷移，各種生長因子大量表達(dá)有關(guān)[7]。

研究表明，EGCG具有抗動脈粥樣硬化、保護(hù)心肌細(xì)胞及調(diào)節(jié)血脂等作用[8]。韓超等[9]報道，EGCG對肥胖大鼠具有減肥作用，本實驗結(jié)果與之一致，但其EGCG有效劑量明顯高于本文報道，考慮可能與本實驗?zāi)Ｐ蜑橛资竽Ｐ?，敏感性較高有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)EGCG具有劑量依賴性地抑制動脈粥樣硬化作用。同時EGCG通過反饋性調(diào)節(jié)組織中AQP-7表達(dá)，改變膜通透性。在肥胖幼鼠模型中，脂肪組織增加，AQP-7表達(dá)增加，腹主動脈中泡沫細(xì)胞增加和鈣化斑塊形成，AQP-7表達(dá)增加，EGCG可通過改變膜通透性，一方面下調(diào)脂肪組織中AQP-7表達(dá)，起到減肥作用；另一方面，通過下調(diào)腹主動脈中AQP-7表達(dá)，減少腹主動脈組織中泡沫細(xì)胞和抑制鈣化斑塊形成，從而改善早期動脈粥樣病變。

[1]Cui Z，Huxley R，Wu Y，et al.Temporal trends in overweight and obesity of children and adolescents from nine Provinces in China from 1991-2006[J].Int J Pediatr Obes，2010，5（5）:365-374.

[2]Whitlock EP，Williams SB，Gold R，et al.Screening and interventions for childhood overweight:a summary of evidence for the US Preventive Services Task Force[J].Pediatrics，2005，116（1）:e125-144.

[3]Bloomfield FH，Oliver MH，Harding JE.The late effects of fetal growth patterns[J].Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，2006，91（4）:299-304.

[4]Page KC，Malik RE，Ripple JA，et al.Maternal and postweaning diet interaction alters hypothalamic gene expression and modulates response to a high-fat diet in male offspring[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，297（4）:1049-1057

[5]Boullu-Ciocca S，Dutour A，Guillaume V，et al.Postnatal diet-induced obesity in rats upregulates systemic and adipose tissue glucocorticoid metabolism during development and in adulthood:its relationship with the metabolic syndrome[J].Diabetes，2005，54（1）:197-203.

[6]鄭緒陽，黃先玫.建立雄性營養(yǎng)性肥胖幼鼠模型的研究[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，2（12）:146-148.

[7]龔裕興，王偉，傅玉才，等.大鼠主動脈內(nèi)膜損傷后新生內(nèi)膜各種生長因子表達(dá)與表沒食子兒茶素沒食子酸酯的干預(yù)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（23）:4473-4479.

[8]Vayalil PK，Katiyar SK.Treatment of epigallocatechin-3-gallate inhibits matrix metallop roteinases-2 and-9 via inhibition of activation of mitogen-activated protein kinases，c-jun and NF-kappaB in human prostate carcinoma DU-145 cells[J].Prostate，2004，59:33-42.

[9]韓超，范小兵，王少康，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對肥胖模型大鼠減肥作用的實驗研究[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2008，36（3）：197-199.