楊 婷，馬 強(qiáng)，董 玉

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

蒙藥協(xié)日嘎處方來源于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》中協(xié)日嘎四味湯散，是由姜黃、黃柏、梔子、蒺藜4味藥組方，具有利尿、清瀉濕熱功能，主要用于小便閉止、尿頻、尿急、尿中帶血、膀胱刺痛，是蒙醫(yī)治療膀胱熱證的首選方劑[1]。協(xié)日嘎中含有姜黃，其主要生物活性成分為姜黃素類化合物和揮發(fā)油[2－3]。姜黃揮發(fā)油除具有廣譜抗菌消炎作用外，還有調(diào)血脂、抗凝、抗氧化、利膽、抗癌、抗艾滋病病毒等作用[4]。筆者建立了測定協(xié)日嘎中總酚酸含量的紫外分光光度法，以控制其內(nèi)在質(zhì)量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

TU－1901型紫外可見分光光度計(jì)(北京);Sartorius－BS224S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司);KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。蒙藥姜黃、黃柏、梔子、蒺藜飲片由內(nèi)蒙古天力藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，產(chǎn)地內(nèi)蒙，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院龐秀生教授鑒定為蒙藥姜黃、黃柏、梔子、蒺藜;姜黃素對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110823－201004);其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

精密稱取姜黃素對(duì)照品適量，加無水甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.059 2 g/L的對(duì)照品溶液。取復(fù)方協(xié)日嘎－4粗粉約10 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加10倍量70%乙醇，加熱回流2 h，趁熱用棉花過濾，濃縮至小體積，置50 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，吸取5 mL，置25 mL量瓶中，并稀釋至刻度，再吸取2 mL，置25 mL量瓶中，以50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 測定波長選擇

分別吸取姜黃素對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，分別置25 mL量瓶中，加無水乙醇至5 mL，加0.3%十二烷基硫酸鈉2.0 mL及0.6% 三氯化鐵 －0.9% 鐵氰化鉀(1 ∶0.9)混合溶液 1.0 mL，混勻，在暗處放置5 min，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，在暗處放置20 min，以相應(yīng)試劑為空白，在400～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果供試品溶液和對(duì)照品溶液均在720 nm波長處有最大吸收，故確定720 nm為測定波長。吸收光譜見圖1。

圖1 紫外吸收光譜圖

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取姜黃素對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為23.68 μg/mL)0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL，置 25 mL 量瓶中，加無水乙醇至5 mL，加0.3%十二烷基硫酸鈉2.0 mL及0.6% 三氯化鐵 －0.9% 鐵氰化鉀(1 ∶0.9)混合溶液 1.0 mL，混勻，在暗處放置5 min，加0.1 mol/L鹽酸溶液至刻度，在暗處放置20 min，以顯色劑為空白，在720 nm波長處測定吸光度。以姜黃素對(duì)照品取樣量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程 Y=8.177 5X+0.127 7，r=0.999 2(n=7)。結(jié)果表明，姜黃素進(jìn)樣量在11.84～82.88 μg范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液1 mL，按擬訂的方法連續(xù)測定6次。結(jié)果吸光度的 RSD=0.22%(n=6)，表明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密量取同一供試品溶液1 mL，按擬訂的方法操作，分別于配制溶液后 0，15，30，45，60，75 min 時(shí)測定。結(jié)果吸光度的 RSD=2.68%(n=6)，表明供試品溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取樣品6份，每份約10 g，精密稱定，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂的方法測定吸光度，計(jì)算含量。結(jié)果的 RSD=1.92%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品粉末約5 g，精密稱定，6份，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取1 mL，精密加入經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的姜黃素對(duì)照品適量，照擬訂的方法，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中姜黃素的質(zhì)量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取不同批次的樣品，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂的方法測定吸光度，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 不同批次樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

選取姜黃素為對(duì)照品，是因姜黃中含有姜黃素[5]，多有報(bào)道且含量較高，可作為含量測定指標(biāo)性成分[6]。并且，姜黃素本身具有多種藥理活性[7]，可代表姜黃中的總酚酸。

復(fù)方協(xié)日嘎－4含有酚類成分，以姜黃素為對(duì)照，采用紫外分光光度法進(jìn)行比色測定，在400～800 nm波長范圍進(jìn)行光譜掃描。最終樣品和供試品在波長720 nm處均有最大吸收，且顯色劑與未顯色樣品在該波長下均無干擾，故選擇720 nm波長作為測定波長。

曾有人以亞硝酸鈉－硝酸鋁配位顯色法顯色[8]，但該方法專屬性較差;用紫外分光光度法測定，pH會(huì)對(duì)測定有顯著影響。本試驗(yàn)采用三氯化鐵－鐵氰化鉀顯色法[9]。比較上述顯色方法，用三氯化鐵－鐵氰化鉀顯色后，對(duì)照品溶液、供試品溶液的λmax基本一致，而且重現(xiàn)性好，故采用三氯化鐵－鐵氰化鉀顯色－比色法對(duì)總酚酸進(jìn)行測定。該反應(yīng)顯色后需放置暗處，見光后操作。隨著時(shí)間的增加，450 nm波長處的吸收值增大，故450 nm處為干擾峰。

姜黃中含有酚酸類成分，并從中提取、分離、鑒定了姜黃素。姜黃主要生物活性成分為姜黃素類化合物和揮發(fā)油[3]。本試驗(yàn)首次以姜黃素為對(duì)照品，對(duì)協(xié)日嘎－4中總酚酸進(jìn)行了含量測定。該方法靈敏、簡便、快速、準(zhǔn)確可靠，為合理、有效開發(fā)、利用復(fù)方協(xié)日嘎－4藥材奠定了基礎(chǔ)。

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