藍(lán) 艷 余艷蓉 王春芳 韋葉生 韋傳東 王俊利 黃照權(quán)

藍(lán) 艷1，余艷蓉2，王春芳3，韋葉生3，韋傳東3，王俊利3，黃照權(quán)4，＊

廣西壯族自治區(qū)百色市右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，百色533000； 1皮膚科； 2燒傷外科； 3檢驗科； 4病理科； ＊通訊作者

白細(xì)胞介素－21 （Interleukin－21，IL－21）是一種新近發(fā)現(xiàn)的I類細(xì)胞因子，主要由活化的CD4＋T細(xì)胞產(chǎn)生，能夠調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化，調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖與調(diào)亡，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用［1～3］。此外，IL－21還具有抗腫瘤作用，與其它細(xì)胞因子、疫苗等聯(lián)合應(yīng)用，有增強(qiáng)其抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能［4］。IL－21 基因定位于人4號染色體長臂上（4q26～27），轉(zhuǎn)錄一條由642個核苷酸組成的成熟mRNA，編碼162個氨基酸組成的蛋白前體，其中前31個氨基酸為信號肽，后131個氨基酸組成具有四螺旋結(jié)構(gòu)域，相對分子質(zhì)量為15k D。目前，有關(guān)IL－21基因rs2221903 T／C多態(tài)性的研究國內(nèi)外較少文獻(xiàn)報道。因此，本文采用單堿基延伸PCR技術(shù)，研究廣西地區(qū)199例健康人群中IL－21基因單核苷酸多態(tài)性（SNP），并與人類基因組計劃（Hap map）公布的4組人群（歐洲人、非洲人、日本人和中國北京人）的SNP分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以探討IL－21基因多態(tài)性在不同種族正常人群中的分布差異，為人類學(xué)及群體遺傳學(xué)研究提供前瞻性基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗對象

隨機(jī)選取廣西地區(qū)無血緣關(guān)系，在廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢健康人群199例，其中男118例，女81例，年齡25～86歲，各項臨床及實(shí)驗室檢查指標(biāo)均正常。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 基因組DNA提取：采集以上人群靜脈血2 ml，用EDTA－K2抗凝；采用已建立的改良碘化鈉法［5］提取白細(xì)胞基因組DNA，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與合成：根據(jù)IL－21基因rs2221903 T／C位點(diǎn)多態(tài)性和已知的DNA序列設(shè)計PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴(kuò)增IL－21基因包含rs2221903 T／C位點(diǎn)堿基的DNA片段的引物，上游引物序列為：5’－TGG ACA CTG ACG CCC ATA TTG A－3’，下游引物序列為：5’－AAG GCA GTT TAG TGG YGA CAG C－3’，延 伸 引 物 為：5’－TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG CTC TGC TGC TTG CAG AAC A－3’。1.2.3 PCR 擴(kuò)增：IL－21的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl，其中含10×PCR 緩沖液2.0μl，0.3 mmol／L d NTPs 2.0μl，上、下游引物各1.0μl，模板 DNA 1.0μl，Taq DNA聚合酶1.0 U，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性20s，65℃退火40s，72℃延伸1.5 min，11個循環(huán)；94℃變性20s，59℃退火30s，72℃延伸1.5 min，24個循環(huán)；72s延伸2 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的Hot Star Taq進(jìn)行多重PCR獲得，經(jīng)蝦堿酶（SAP）（pro mega公司，美國）和外切酶I（EXOI）（Epicentre公司，美國）純化后用 ABI公司的SNa PshoTMultiplex Kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。PCR延伸程序：96℃預(yù)變性1 min，96℃變性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，28個循環(huán)，4℃保存。延伸產(chǎn)物測序：取0.5μl延伸產(chǎn)物，用SAP純化，95℃變性5 min后上ABI 3130 XL測序儀進(jìn)行測序，測序結(jié)果見圖1。SNP 分型用 Gene Mapper4.0（Appliedbiosyste ms）分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因直接計數(shù)法計算，各組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 廣西人IL－21基因型檢測結(jié)果

IL－21基因rs2221903 T／C多態(tài)性，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為230bp。經(jīng)ABI 3130XL基因檢測儀SNP分型，結(jié)果顯示廣西人IL－21基因rs2221903 T／C位點(diǎn)檢測到TT、TC和CC三種基因型。

2.2 廣西人IL－21基因多態(tài)性分布

IL－21基因rs2221903 T／C位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率符合Hardy－Weinberg遺傳平衡，說明所選研究樣本具有群體代表性。其中rs2221903 T／C位點(diǎn)基因型以TT型最為常見，占75.38%；其等位基因以T型頻率最高，占87.19%。其基因型頻率分布的男女性別間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

2.3 IL－21基因多態(tài)性在不同種族人群中的分布比較

將廣西人IL－21基因rs2221903 T／C多態(tài)性分布頻率與人類基因組計劃 （htt p：／／www.ncbi.nl m.nih.gov／projects／SNP／）公布的歐洲人、非洲人、日本人和中國北京人的SNP分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)中國廣西人基因型及等位基因的分布頻率與歐洲人和非洲人比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而與日本人和中國北京人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與中國安徽人［6］比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖1 IL－21基因rs2221903 T／C測序圖

表1 IL－21基因型及等位基因頻率在廣西地區(qū)人群中的分布（n，%）

表2 不同種族及地區(qū)人群IL－21基因rs2221903 T／C多態(tài)性分布頻率比較（n，%）

3 討 論

隨著人類基因組研究的進(jìn)展，已經(jīng)認(rèn)識到不同的基因背景可以造成人們對某些疾病不同的易感性。通過對人類基因多態(tài)性的研究可以了解各種基因的不同基因型在人群中的分布，有助于從基因水平更深刻地闡明各種疾病在不同種族、不同人群中存在不同發(fā)病率和不同臨床表現(xiàn)、臨床特點(diǎn)的內(nèi)在機(jī)制。因此，基因多態(tài)性的研究是解釋多種疾病臨床表現(xiàn)多樣化的一個有用工具。而在對一些致病基因的多態(tài)性分布進(jìn)行研究時，首先了解其在正常人群中的分布特點(diǎn)是正確分析基因多態(tài)性與疾病之間關(guān)系的前提條件。

IL－21是一類由激活的CD4＋T細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞（NKT）分泌產(chǎn)生的I型細(xì)胞因子，大量研究發(fā)現(xiàn)，IL－21是一個重要的免疫調(diào)節(jié)分子，通過與其受體（IL－21R）特異性結(jié)合而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用，如抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等［7～9］。IL－21基因位于4號染色體長臂上（4q26～27），包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，IL－21基因存在單核苷酸多態(tài)性，這種基因多態(tài)性可能影響IL－21基因的功能，進(jìn)而可能影響到IL－21基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。Ding等［6］和Sawalha等［10］研究發(fā)現(xiàn)，IL－21基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病顯著相關(guān)。Jia等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在格雷夫斯（氏）病患者中，IL－21等位基因及單倍體與該病發(fā)生顯著相關(guān)。此外，國外學(xué)者的研究表明，IL－21基因多態(tài)性在I型糖尿病及反復(fù)自發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病的遺傳因素中起重要作用［12，13］。因此，正確分析和闡明IL－21基因多態(tài)性在不同種族和地域人群中的分布特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究不同人群中IL－21基因多態(tài)性與某些疾病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系提供理論依據(jù)和分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

本文應(yīng)用單堿基延伸PCR技術(shù)檢測了廣西地區(qū)正常人群中IL－21基因rs2221903 T／C位點(diǎn)多態(tài)性的分布情況，結(jié)果顯示，在所觀察人群中，rs2221903 T／C位點(diǎn)表現(xiàn)出TT、TC和CC三種基因型，以TT型最為常見（75.38%），其等位基因以T最為常見（87.19%）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，IL－21基因rs2221903 T／C位點(diǎn)基因型分布頻率男女組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示該位點(diǎn)基因型分布頻率與性別無關(guān)。將中國廣西地區(qū)人與歐洲人、非洲人、日本人、中國北京和安徽等人群基因多態(tài)性研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，廣西健康人群中IL－21基因rs2221903 T／C位點(diǎn)T等位基因頻率（87.19%）顯著高于歐洲人（63.72%）、顯著低于非洲人（95.58%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而與日本人、中國北京人及安徽人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從本文結(jié)果可以看到，IL－21基因型分布及等位基因頻率在不同種族間存在著明顯的差異，這一結(jié)果符合遺傳學(xué)規(guī)律，即親緣關(guān)系越近，其基因型分布越相似，反之差異越顯著。

綜上所述，對中國廣西人IL－21基因rs2221903 T／C多態(tài)性的研究，不僅有利于認(rèn)識臨床上與IL－21基因相關(guān)的多種疾病在不同種族和地域表現(xiàn)出來的差異，而且進(jìn)一步為人類學(xué)及群體遺傳學(xué)的研究和基因多態(tài)性普查奠定了基礎(chǔ)，并為疾病前瞻性研究提供了重要的分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。

致謝：感謝上海天昊生物科技有限公司丁達(dá)和劉燕兩位博士在實(shí)驗過程中給予的大力支持和幫助！

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